植物乳桿菌中膽鹽水解酶結構基因的克隆與序列分析

李蓉，于長青

（黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶163319）

膽鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)是由bsh基因編碼的一種胞內酶[1-2]，是微生物在生長和繁殖過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，微酸環(huán)境下的最適pH值一般在5和6之間，對氧氣不敏感，該酶已經(jīng)從多種微生物中得到了分離和鑒定[3-4]。目前，發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株都是革蘭氏陽性菌，其中包括部分的益生菌株，如：乳酸菌、雙歧桿菌等該酶主要由乳酸菌產(chǎn)生。BSH可能對膽固醇和氨基酸基團(甘氨酸/?；屈S氨酸)都具有識別性，有文獻報道BSH酶能識別膽酸酯基團。Moser和Savage[5]的研究發(fā)現(xiàn)JCM1069布氏乳桿菌表達?；撬崦撗跄懼崴饷傅槐磉_牛磺酸膽汁酸水解酶。BSH能水解結合態(tài)?；撬崮扄}和甘氨酸膽鹽，將其轉變成氨基酸和游離膽酸。

血清中高水平的膽固醇是誘發(fā)高血壓、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素[6-7]，所以如何控制血清膽固醇水平已經(jīng)受到越來越廣泛的關注。藥物治療存在藥費昂貴，毒副作用較大、治療效果不明顯等缺陷。目前，口服益生菌是研究的熱點，它的治療效果明顯，能夠顯著地降低血清膽固醇的含量，對高血脂的防治有積極的作用[8-9]。BSH酶能水解結合態(tài)?；撬崮扄}和甘氨酸膽鹽，轉變成氨基酸和游離膽酸，作用后產(chǎn)生的去結合型膽鹽比結合型膽鹽重吸收效率低，致使大量的去結合型膽鹽從糞便中排出。去結合型膽鹽的大量流失使得體內需要消耗更多的膽固醇重新合成膽酸鹽來彌補損失，從而逐步使血清膽固醇水平降低[10-11]去結合膽鹽能夠降低血清中膽固醇的含量，主要通過以下兩個途徑：一是通過合成膽酸來補充那些隨糞便排出的膽酸來增加膽固醇的需求量；二是降低了膽固醇的溶解度，減少了腸腔對膽固醇的吸收，使膽固醇與脫結合膽鹽一同沉淀下來。

BSH是絕大部分乳桿菌和大量益生菌產(chǎn)生的胞內酶，目前有關膽鹽水解酶的研究報道相對較少，國內的研究主要集中在降膽固醇機理、高產(chǎn)BSH酶優(yōu)良菌株的篩選、BSH酶的純化等方面；而國外也則正在進行有關BSH酶微生物分子生物學等方面的研究，但還至今未見有突破性進展。研究主要將植物乳桿菌中的BSH結構基因進行克隆，為BSH基因的功能及基因工程的進一步研究奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 菌種及質粒

植物乳桿菌Lp M1-UVS29、E.coliDH5α由黑龍江八一農墾大學食品學院保存；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑

DNA Ladder 2000、rTaqDNA聚合酶、NcoⅠ和Hind III等限制性內切酶及T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；質粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒均購自博大泰克公司；瓊脂粉、瓊脂糖、氨卞青霉素（Amp）、胰蛋白胨、酵母提取物等購自上海生工公司；SDS購于Sigma公司。

1.3 引物的設計與合成

參照Genbank中已報道的膽鹽水解酶全長基因序列（EU477374），利用Primer 5軟件設計了一對擴增BSH酶編碼區(qū)序列的特異性引物，引入酶切位點Hind III/NcoI，引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5'AAT CCA TGG ATG TGT ACT GCC ATA ACT TAT C 3'；下游引物：5'AAT GAG CTC TAT TAG TTA ACTGCA TAG TAT TGTG 3'。

1.4 BSH基因的PCR擴增

采用CTAB法[12]提取植物乳桿菌基因組DNA，以DNA為模板，進行PCR擴增BSH結構基因，PCR反應體系為2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTPs，1μL模板DNA，上下游引物分別為0.5μL，0.2μL TaqDNA聚合酶，最后加ddH2O至終體積為25μL。PCR反應條件為：95℃預變性5 min，94℃變性50 s，48℃退火50 s，72℃延伸1 min，經(jīng)過30個循環(huán)，72℃再延伸10min[12]。

1.5 目的基因的克隆及測序

利用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)E.coliDH5α，37°培養(yǎng)12～16 h。經(jīng)藍白篩選獲得陽性重組子命名為pMD18-BSH；進行質粒小量提取，經(jīng)PCR（反應體系和反應條件同上）以及雙酶切鑒定，篩選陽性重組子，最后送至上海生工生物工程技術服務公司進行測序，將獲得DNA序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的已知功能基因進行序列同源性比較以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增BSH結構基因

取5μL PCR擴增BSH結構基因的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在接近1 000 bp處可見特異性目的條帶，見圖1。

圖1 BSH基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR productof BSH gene

2.2 重組克隆質粒的鑒定

重組克隆質粒pMD18-BSH的PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在接近1 000 bp處可見特異性目的基因條帶，見圖2。

圖2 重組克隆質粒pMD-BSH的PCR鑒定Fig.2 The PCR identity of pMD18-/BSH clone vector

圖3 重組克隆質粒pMD-BSH的酶切鑒定M：DL2000：標準分子量；1：pMD18-BSH；2：pMD18-BSH（BamH I/Sal I）Fig.3 Restrictionmap of recombinant plasmid pMD18-BSH

2.3 測序比對結果

使用DNAMAN軟件，將測序的核苷酸序列與Genebank已公布的序列（EU477374）進行比對，結果顯示兩者同源性高達99.3%。由于菌株的特異性和遺傳密碼子的簡并性，所以核苷酸序列有個別差異。見圖4。

3 結論

研究采用PCR技術從植物乳桿菌Lp M1-UVS29基因組中得到了BSH基因片段，通過克隆、測序，得到其核苷酸序列，為995 bp。對其核苷酸序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)BSH基因的核苷酸序列與Genbank(EU477374)有較高的同源性。同源性高達99.3%，證明成功克隆了BSH結構基因。

圖4 測序的核苷酸序列與Genebank（EU477374）比對Fig.4 The comparison between the predicted amino acid sequence and the EU477374

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