大孔吸附樹脂對(duì)虎杖中虎杖苷的吸附分離效果的研究

趙愉快，劉仲華，莫卓群

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

虎杖別名花斑竹（polygonum cuspidatum Sieb et Zucc），是蓼科屬多年生草本植物，其干根、莖入藥，性味苦寒[1]?；⒄溶帐瞧溆行С煞种唬哂袕?qiáng)心擴(kuò)血管、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)咳平喘、祛風(fēng)利濕、散瘀、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[2-4]，在臨床應(yīng)用上有重要價(jià)值。筆者研究了大孔吸附樹脂對(duì)虎杖苷的吸附和解吸特征及效果，旨在為簡(jiǎn)化虎杖苷分離工藝和提高收率提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥 材 虎杖藥材（湖南美可達(dá)生物資源有限公司）。

1.1.2 試 劑 乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；甲醇、乙醇（分析純）；水（蒸餾水）；D101、AB-8、HPD-100、HPD-500（安徽三星樹脂科技有限公司）；虎杖苷（湖南美可達(dá)生物資源有限公司）。

1.1.3 儀器和設(shè)備 HH數(shù)顯恒溫水浴箱（金壇市金域國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；DHG-9154A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SK3300H超聲波清洗儀（上?？茘u超聲儀器有限公司）；予華SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；ZK-82B型真空干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；AE-240電子天平（METTER TOLEDO公司）；800-1電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）；Waters 1525高效液相色譜儀、2487雙通道紫外可見檢測(cè)器、2707自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 將新購(gòu)買 D101、AB-8、HPD-100、HPD-500樹脂分別用95%乙醇在室溫下密封浸泡24 h，使其充分溶脹；濕法裝柱；用2倍樹脂體積的95%乙醇，以2 BV/h的流速通過(guò)樹脂床[5]，直至流出的乙醇沖洗液與蒸餾水等量混合無(wú)混濁，并在紫外波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)；檢測(cè)除了乙醇本身的吸收外無(wú)其它吸收為止，后備用。

1.2.2 虎杖苷的HPLC法測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。（1）精密稱取虎杖苷64.8mg，分別于25mL棕色容量瓶中，80%甲醇溶液溶解并定容至刻度。分別取上述對(duì)照品溶液 1，2，4，6，8mL 于 25mL 棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至刻度，得5個(gè)不同濃度的對(duì)照品液。

（2）上樣液的制備。稱取1 g虎杖細(xì)粉，分別加入5、4、3倍量80%甲醇液，60℃，磁力攪拌提取3次，時(shí)間分別3、2、2 h，所得濾液混和，減壓濃縮至40%醇過(guò)濾，濾液繼續(xù)濃縮至無(wú)醇味，加等體積的蒸餾水超聲過(guò)濾，濾液即為上樣液。

（3）虎杖苷含量的測(cè)定。依利特色譜柱Hypersil ODS2C18（4.6×200 mm），流動(dòng)相為乙腈∶水（23∶77）；柱溫：25℃；流速為 1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 303 nm；進(jìn)樣量為5μL。

1.2.3 虎杖苷靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn) 分別稱取D101、AB-8、HPD-100、HPD-500 經(jīng)預(yù)處理后的大孔吸附樹脂各2.00 g，置于100mL錐形瓶中，向瓶中加入25 mL上樣液，室溫下（25℃），搖床震蕩吸附12 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。吸附平衡后，過(guò)濾出溶液，取上清液5μL測(cè)定虎杖苷的質(zhì)量濃度。將吸附飽和樹脂用蒸餾水洗至無(wú)色，置于100mL錐形瓶中，加入25mL 70%乙醇，連續(xù)震蕩解吸12 h。測(cè)定解吸液中虎杖苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算出樹脂的靜態(tài)吸附量、解吸率。找出適合虎杖苷分離的吸附樹脂。

靜態(tài)吸附量（mg/g）=[（吸附前溶液中虎杖苷的濃度-吸附后溶液中虎杖苷的濃度）×溶液體積]/樹脂總重量（g）

靜態(tài)解吸率（%）=[解吸液虎杖苷量/（吸附前溶液中虎杖苷量-吸附后溶液中虎杖苷）]×100

1.2.4 虎杖苷動(dòng)態(tài)吸附和洗脫試驗(yàn) （1）上樣液濃度的確定。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂6份，每份2.00 g，裝入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取樣液 6份，每份10 mL，分別加入 0、10、20、30、40、50mL 蒸餾水，制成虎杖苷濃度分別為 3.04、1.51、1.01、0.76、0.61、0.51 mg/mL 的 上 樣液，混勻后上柱，以3 BV/h的流速通過(guò)玻璃柱，收集過(guò)柱液，檢測(cè)虎杖苷含量。

（2）上柱液流速對(duì)吸附的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂5份，每份2.00 g，裝入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取樣液5份，濃度為0.76 mg/mL，以不同流速通過(guò)玻璃柱，收集過(guò)柱液檢測(cè)虎杖苷含量?？疾?1、2、3、4、5 BV/h 的流速對(duì)樹脂吸附率的影響。

（3）乙醇濃度對(duì)解吸的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂4份，每份5.00 g，裝入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取樣液4份，濃度為0.76mg/mL，以流速為3 BV/h通過(guò)玻璃柱4BV柱體積水洗后，再用3 BV不同濃度乙醇2 BV/h洗柱，收集解吸液檢測(cè)虎杖苷含量?？疾?0%、50%、70%、95%乙醇濃度對(duì)樹脂解吸率的影響。

（4）洗脫劑流速對(duì)解吸的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂4份，每份5.00 g，裝入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取樣液4份，濃度為0.76mg/mL，以流速為3 BV/h通過(guò)玻璃柱，4 BV柱體積水洗后，再用4 BV 70%濃度乙醇不同流速洗柱，收集解吸液檢測(cè)虎杖苷含量?？疾?、2、3、4 BV/h流速對(duì)樹脂解吸率的影響。

（5）乙醇用量對(duì)解吸的影響。稱取已處理好的HPD-500型大孔吸附樹脂2.00 g，裝入玻璃柱（φ1.2 cm×18 cm）中，吸取濃度為0.76 mg/mL上樣液，以流速為3 BV/h通過(guò)玻璃柱，4 BV柱體積水洗后，再用70%濃度乙醇2 BV/h洗柱，收集解吸液檢測(cè)虎杖苷含量?？疾?1、2、3、4、5 BV 乙醇用量對(duì)樹脂解吸的影響。

1.2.5 虎杖苷產(chǎn)品純度的測(cè)定 根據(jù)以上試驗(yàn)確定的最佳條件，進(jìn)行產(chǎn)品純度驗(yàn)證。取等體積的上樣液兩份，一份直接濃縮、真空干燥得產(chǎn)品A。另一份上樣液根據(jù)上面試驗(yàn)確定最佳條件過(guò)HPD-500樹脂，解吸下來(lái)的洗脫液分別進(jìn)行濃縮、真空干燥得產(chǎn)品B。將二產(chǎn)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖苷的HPLC法測(cè)定

取上樣液適量離心，離心液過(guò)0.45μm微孔濾膜，進(jìn)樣測(cè)定峰面積值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算質(zhì)量濃度。對(duì)照品和上樣液的HPLC圖譜見圖1，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)分別得線性方程：y=3 348 432 x-10 630，r2=0.999 9，線性范圍為 0.1～

0.8 mg/mL。

2.2 虎杖苷靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)

不同樹脂的物理參數(shù)及對(duì)虎杖苷靜態(tài)吸附、解吸結(jié)果見表1。從表1中可看出，HPD-500型大孔吸附樹的吸附量和解析率均為最高。是虎杖苷的最適分離樹脂。

2.3 虎杖苷動(dòng)態(tài)吸附和洗脫試驗(yàn)

2.3.1 上柱液濃度對(duì)吸附率的影響 上柱液濃度對(duì)吸附率的影響結(jié)果見表2。結(jié)果表明：上樣液中虎杖苷質(zhì)量濃度過(guò)低或過(guò)高均不利于吸附的進(jìn)行，上樣液虎杖苷質(zhì)量濃度在0.76 mg/mL時(shí)，吸附量達(dá)到最大27.9mg。上樣液較稀時(shí)，上樣液粘度較小，在一定上樣流速下，溶液通過(guò)柱床流速較快，虎杖苷不能有效被樹脂吸收，部分虎杖苷直接流出；如果上樣溶液濃度太大，被吸附物質(zhì)在樹脂內(nèi)部擴(kuò)散速度變慢，使樹脂局部吸附快速達(dá)到飽和，部分虎杖苷還沒來(lái)得及被吸附就流出來(lái)，這兩種情況均未達(dá)到樹脂的最大吸收。

圖1 虎杖苷對(duì)照品（A）和樣品（B）的HPLC色譜圖

表1 不同樹脂的物理參數(shù)及對(duì)虎杖苷靜態(tài)吸附、解吸結(jié)果

表2 上柱液濃度對(duì)吸附率的影響

2.3.2 上柱液流速對(duì)吸附的影響 上柱液流速對(duì)吸附的影響結(jié)果見圖2。從圖2可知，上柱液流速太快，會(huì)導(dǎo)致吸附率降低。主要原因是上柱液跟樹脂的接觸時(shí)間太短，虎杖苷來(lái)不及被樹脂有效吸附就直接流出。流速慢有利于樹脂對(duì)虎杖苷的吸附，但是流速太慢，會(huì)使作業(yè)周期增長(zhǎng)，浪費(fèi)時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，吸附時(shí)，流速以取2 BV/h為好。

圖2 上注液流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

2.3.3 乙醇濃度對(duì)解吸的影響 乙醇濃度對(duì)解吸的影響結(jié)果見圖3。結(jié)果表明：HPD-500樹脂用70%乙醇解吸時(shí)解吸率高，提高乙醇濃度對(duì)解吸率影響很小，因此，應(yīng)選擇70%乙醇為洗脫劑。

圖3 不同濃度乙醇洗脫劑對(duì)虎杖苷解吸率的影響

2.3.4 洗脫劑流速對(duì)解吸的影響 洗脫劑流速對(duì)解吸的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，洗脫流速在1～2 BV/h時(shí)有較好的洗脫效果。為提高生產(chǎn)效率，洗脫流速確定為2 BV/h。

圖4 洗脫劑流速對(duì)解吸率的影響

2.3.5 乙醇用量對(duì)解吸的影響 乙醇用量對(duì)解吸的影響結(jié)果見圖5。從圖5可知，解吸率隨洗脫劑用量的增加而提高，洗脫劑用量為4 BV和5 BV時(shí)兩者的解吸率相近，從節(jié)能的角度考慮，乙醇洗脫劑用量宜選擇4 BV。

2.4 產(chǎn)品純度的測(cè)定

圖5 乙醇用量對(duì)虎杖苷解吸率的影響

大孔樹脂純化效果見表3。從表3中可以看出，上柱后總虎杖苷的轉(zhuǎn)移率為91.5%左右，二者總虎杖苷含量相差2.6倍，說(shuō)明HPD-500樹脂對(duì)虎杖苷起到了很好的吸附效果。

表3 大孔樹脂純化效果

3 討論

不同類型的樹脂對(duì)虎杖中虎杖苷的吸附性能為極性（HPD-500）>弱極性樹脂（AB-8）>非極性樹脂（D101、HPD-500），顯示極性樹脂和弱極性樹脂對(duì)虎杖中虎杖苷有較好的吸附性能。解吸率也同樣以HPD-500最大。原因可能是虎杖苷分子帶有2個(gè)酚羥基，具有多酚的結(jié)構(gòu)，顯弱極性，可以作為一個(gè)良好的氫鍵供體，另外它接了1個(gè)葡萄糖分子，增強(qiáng)了虎杖苷的極性，有利于極性大孔樹脂吸附。

通過(guò)對(duì)HPD-500的動(dòng)態(tài)吸附研究，選用0.76 g/mL上樣溶液，2 BV/h的流速過(guò)HPD-500吸附，用4BV70%的酒精洗脫為虎杖苷的最佳吸附分離條件。上樣溶液經(jīng)HPD-500的吸附分離虎杖苷的含量百分?jǐn)?shù)從12.3%上升到32.0%，提高了近2.6倍。

研究結(jié)果表明，HPD-500樹脂具有吸附快、吸附量大，易解吸等特點(diǎn)，優(yōu)于其他幾種樹脂，是一種較理想的吸附分離介質(zhì)。試驗(yàn)研究確定的虎杖苷分離工藝為進(jìn)一步純化虎杖苷提供了借鑒，亦為綜合利用虎杖苷提供了參考。

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