骨髓間充質(zhì)干細胞在中醫(yī)理論中的歸屬*

卞 琴，沈自尹，王擁軍

1 骨髓間充質(zhì)干細胞的發(fā)現(xiàn)

1867年，德國病理學家 Cohnheim在研究創(chuàng)傷愈合時，提出了骨髓中可能存在非造血組織干細胞的觀點。1974年，F(xiàn)riedenstein等證實了這種觀點，他們首先報道了骨髓標本中小部分貼附細胞在培養(yǎng)過程中能夠分化形成類似骨或軟骨的集落，推測這種細胞可能是間質(zhì)細胞的前體細胞，并將之稱為“骨髓多能基質(zhì)干細胞”［1］。1987年，Owen等在分離培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)這些細胞形狀呈成纖維細胞樣，因而稱其為“成纖維細胞集落形成單位”(Colony.forming unifibroblastic，CFU-F)。1988 年，Mamiatopoulos等首次報道鼠骨髓基質(zhì)在體外培養(yǎng)能形成鈣化的骨樣組織，經(jīng)X線衍射分析確定形成的鈣化物具有羥基磷灰石結(jié)構(gòu)，證明體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)具有成骨能力。1989年，Benakyahu等將MSC體外培養(yǎng)獲得具有典型的成骨細胞特性的細胞:具有較高的堿性磷酸酶活性，只產(chǎn)生I型膠原，在條件培養(yǎng)液中可以產(chǎn)生礦化的細胞外基質(zhì)。1991年Caplan將其命名為骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其對骨髓血系細胞具有支持誘導作用且又來自骨髓基質(zhì)，故將其稱為“骨髓基質(zhì)細胞(Bone marrow stromal cell，BMSCs)”。特別是在 1999 年，Pittenger在《Science》上發(fā)表文章宣布其分離到骨髓來源的單個 MSC，產(chǎn)生了極大反響，對其認識及研究也更加深入并成為熱點。

研究深入后發(fā)現(xiàn)，MSC在不同的誘導條件下，具有向中胚層組織細胞分化的能力，故又稱其為“間充質(zhì)干細胞”、“間充質(zhì)祖細胞”(Mesenchymal progenitor cell)、骨髓基質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal stem cell)和基質(zhì)祖細胞(Stromal precursor cell)。2001年 Minguell等將 MSCs概括為:存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細胞來源的細胞亞群，可在體外擴增，體外經(jīng)誘導后可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌管、神經(jīng)細胞與支持造血干細胞的基質(zhì)細胞。

2 骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性

2.1 鑒定

目前為止，還沒有1個特異性的骨髓間充質(zhì)干細胞的標志。由于目前相關(guān)的命名很多，國際細胞治療委員會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)推薦命名為“多潛能間充質(zhì)細胞(multipotent mesenchymal stromal cells，MSC)，并且定義了鑒定 MSC的最低標準，主要包括以下3方面［2］:(1)在正常培養(yǎng)條件下，可以貼附在塑料表面;(2)流式細胞儀檢測:＞95%的 MSC群表達CD73(ecto 5’nucleotidase，5’核 苷 酸 酶)，CD90(Thy-1)和 CD105(endoglin，內(nèi)皮因子);同時，＞98%的MSC不表達造血干細胞表面抗原:CD45(白細胞標志)CD34(造血干細胞祖細胞和內(nèi)皮細胞標志)、CD11b或者CD14(單核細胞標志)、CD19或者CD79a(B細胞標志)以及HLA家族2;(3)在適當?shù)恼T導條件下，具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化的潛能。

2.2 MSC分離

原代MSC的分離主要是利用其黏附在塑料表面的特性，然而這種分離程序相對耗時，無法排除異種細胞的污染。因此，近年也陸續(xù)報道了新的分離方法。如利用MSC與細胞外基質(zhì)的親和力來分離和擴增，常用的有 I型膠原和纖維蛋白［3、4］。此外，表面抗體也常用來分離 MSC和造血干細胞，包括CD49a、CD 105、Stro-1［5、6］，雙標記抗體有 Stro-1 和V-CAM。這些方法比單純的塑料表面貼壁法得到的 MSC 要多出 1000倍［7］。

2.3 組織來源

除了骨髓來源外，這種多潛能間充質(zhì)細胞還可從出生后及成人的臍帶血、胎盤、外周血、骨骼肌、皮膚、脂肪組織、滑膜、心臟、靜脈和動脈壁上分離獲得［8、9］。事實上，MSC 幾乎存在于胚胎的所有組織中，包括腦、脾臟、肝臟、腎臟、肺、胰臟、胸腺等［10］。除了胎盤和臍帶血，皮下脂肪抽吸被認為是獲得MSC的另一種簡便和損傷性相對較小的方法，且脂肪組織中的MSC比例高。對59位平均年齡49歲的志愿者研究發(fā)現(xiàn)，MSC占有核細胞的2%［11］，而在骨髓組織中僅占到0.01%，且MSC在骨髓中的比例與年齡密切相關(guān)。出生時MSC與有核細胞的比例是 1∶10000，10 歲左右是 1∶00000，30 歲是 1∶250000，50 歲是 1∶400000，到80 歲是1∶2000000(見圖1)［12］。200ml的脂肪抽吸可獲得 100萬個干細胞，是 40ml骨髓抽吸的 40倍左右［11］。

圖1 人骨髓內(nèi)BMSCs與有核細胞比例隨年齡變化趨勢

雖然MSC與其他細胞表面抗原沒有明顯的差異，但是有學者提議全基因表達譜是深入研究MSC特性的有效方法［13］。從脂肪、臍帶和骨髓中分離出的MSC，由于個體來源不同，因此許多基因的表達也不同。如骨髓來源的MSC與滑膜來源的MSC進行基因芯片比較后發(fā)現(xiàn)，2組表面抗原非常相似，但是268個細胞因子受體轉(zhuǎn)錄因子中有46個出現(xiàn)差異［14］。此外，基因表達在MSC傳代到3～6代內(nèi)都保持穩(wěn)定［15］。

2.4 定向分化誘導劑

成骨細胞:在培養(yǎng)基中加一定濃度的地塞米松、抗壞血酸，beta甘油磷酸鹽合用，或者單獨加細胞因子BMP2，特異的成骨細胞標志檢測包括:茜素紅染色、ALP、Cbfa1/Runx2、Osteopontin、Osteocalcin、ColI等。

軟骨細胞:3D-藻酸鹽培養(yǎng)，在高糖DMED培養(yǎng)基中加入地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸鹽、脯氨酸、TGF-beta3、BMP-6。特異的軟骨細胞檢測標志包括阿爾辛蘭染色、aggrecan、ColII、Sox-9 等。

脂肪細胞:過氧化物酶體增殖激活受體gamma(PPARgamma)激動劑(如羅格列酮);合用氫化可的松、異丁甲基黃嘌呤、吲哚美辛。特異的脂肪細胞檢測標志包括油紅染色、LPL、PPARgamma 等［16、17］。

2.6 細胞株

除了原代MSC外，常用的細胞株有小鼠間充質(zhì)祖細胞系C3H10T1/2和分化系明確的細胞株如前脂肪細胞 3T3L1、前成骨細胞 3T3-E1［18］。

3 骨髓間充質(zhì)干細胞在中醫(yī)理論中的歸屬

3.1 “髓”

骨髓間充質(zhì)干細胞的特性之一就是向成骨分化，這一特性與中醫(yī)“腎藏精，精生髓，髓生骨”的理論有較高的吻合。因為骨髓間充質(zhì)干細胞主要來自于骨髓(髓)，而在特定環(huán)境下能向成骨轉(zhuǎn)化，即實現(xiàn)“髓生骨”。許多補腎藥物對 BMSCs的增殖和成骨分化都有促進作用，從而證實了“腎”、“髓”、“骨”之間的關(guān)聯(lián)?！澳I主骨”可能是通過補腎藥物作用到“髓”中的干細胞，促使其成骨分化來實現(xiàn)的，因此BMSCs屬中醫(yī)“髓”的范疇。

筆者對近5年文獻檢索結(jié)果進行了總結(jié)。復方研究發(fā)現(xiàn)，補腎壯骨功效的骨康含藥血清能抑制BMSCs的成脂化［19］。具有補肝腎強筋骨功效的透骨消痛顆粒含藥血清可促進BMSCs向軟骨細胞分化［20］。單味中藥研究發(fā)現(xiàn)，龜板、杜仲的含藥血清可以促進BMSCs的增殖，成骨分化有利于細胞脫氧核糖核酸(DNA)合成［21］。有效組分研究發(fā)現(xiàn)，龜板中十四酸甾醇酯和十六酸甲酯具有促BMSCs增殖的作用［22］。

3.2 “精”

3.2.1 先天之精 張進等認為，受精卵作為全能干細胞蘊藏了全部先天之精，是精的來源。將全能干細胞與多種成體干細胞的功能與“先天之精”的繁衍生殖、生長發(fā)育等功能相比較，“先天之精”與干細胞的基本屬性較相似。

具有補腎填精作用的地黃飲子、三甲復脈湯、龜板、刺五加、熟地黃的有效成分地黃多糖可體外誘導BMSCs轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元樣細胞，闡釋了“腎藏精、精生髓、腦為髓之海”的理論(《靈樞·海論》?！端貑枴の迮K生成》:諸髓者，皆屬于腦［23、24］。補腎藥通過作用于 BMSCs(精)，使其轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞(精生髓)，即腦髓內(nèi)神經(jīng)細胞的來源(腦為髓之海)。

3.2.2 脾腎相關(guān) 具有補脾益損功效的強肌健力口服液能促使BMSCs的增殖和向成肌細胞分化，說明 BMSCs來源于先天腎之精，在后天一定條件下可以向“脾”轉(zhuǎn)化［25、26］。補脾法能促使干細胞的生長，為“后天濟先天”提供了一定依據(jù)。BMSCs可能是“脾腎相關(guān)”細胞層次的表達形式，但究其實質(zhì)仍屬于“先天之精”范疇。

3.2.2 精血同源 活血化瘀法對BMSCs的增殖尤其是分化具有促進作用。如具有活血化瘀功效的桃紅四物湯，能抑制激素誘導下的BMSCs成脂分化［27］;調(diào)節(jié)“腦中血?！钡闹兴幠X脈 1號，可促進BMSCs向局灶性腦缺血模型大鼠移植后的血管再生［28］;復方丹參注射液可體外誘導大鼠BMSC分化為成軟骨細胞、神經(jīng)元樣細胞［29、30］。丹參有效成分丹酚酸B誘導BMSCs向心肌樣細胞分化，有效改善BMSCs移植后的血管微環(huán)境;其預處理的內(nèi)皮祖細胞聯(lián)合BMSCs的移植，促進急性心梗模型大鼠左心室功能的恢復［31～33］。三七有促進 BMSCs增殖并向血管內(nèi)皮細胞分化的作用［34］;三七總皂苷、參三七皂苷Rg，預適應(yīng)在體外可顯著刺激5-氮胞苷誘導的鼠BMSCs向心肌細胞轉(zhuǎn)化和增殖，改善細胞形態(tài)，刺激細胞內(nèi)鈣離子增加，與5-氮胞苷產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)［35、36］。銀杏內(nèi)酯B可促進MSCs向神經(jīng)樣細胞分化，且具有神經(jīng)元基本電生理功能［37］。

但是關(guān)于這部分的理論解釋基本是從活血化瘀治療相關(guān)疾病如心梗、腦缺血等角度展開的，沒有就BMSCs的作用深入分析。筆者認為，在這些研究中，BMSCs扮演的仍然是“精”的角色，BMSCs取自于骨髓，與造血干細胞是一個來源，這兩種干細胞相互影響、相互作用，形成干細胞龕(微環(huán)境)。這些活血化瘀中藥除了對BMSCs本身具有促進作用外，還改善了其移植后的微環(huán)境。雖然實驗研究是從BMSCs向其他細胞分化，而不是造血干細胞，但最終改善的都是缺血微環(huán)境，因此說“精血同源”。

3.2.3 精氣互化 大量的實驗發(fā)現(xiàn)，具有益氣功效的中藥復方、單味和有效同樣能促進BMSCs的增殖和向其他細胞的分化。如具有益氣養(yǎng)陰功效的心復康聯(lián)合BMSCs移植，較單純細胞移植對急性心梗大鼠模型具有更顯著的保護作用［38］。芪丹通脈片含藥血清誘導BMSCs向內(nèi)皮細胞分化，修復血管內(nèi)皮細胞凋亡［39、40］。益氣活血方可誘導 BMSCs向神經(jīng)元特異性烯醇化酶細胞和膠質(zhì)纖維酸性蛋白分化［41］。黃芪含藥血清可誘導 BMSCs分化為心肌樣細胞、內(nèi)皮細胞［42］。黃芪甲苷可在體外誘導大鼠BMSCs定向分化為心肌樣細胞［43］;人參莖葉皂苷、人參皂苷Rb1對小鼠BMSC具有生長促進作用，并可誘導分化為心肌樣細胞和神經(jīng)元樣細胞［44、45］。

但在這些文獻中均沒有涉及BMSCs的中醫(yī)歸屬?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》云:“氣歸精……精化為氣?！泵鳌埦霸馈额惤?jīng)》注釋:“精化為氣，謂元氣由精而化也……然上文既云氣歸精，是氣生精也，而此又曰精化氣，是精生氣也。二者似乎相反，而不知此正精氣互根之妙，以應(yīng)上文天地云雨之義也。”說明精、氣互化。此理論可解釋補氣促使 BMSCs(先天之精)轉(zhuǎn)化為五臟(心肌樣細胞、神經(jīng)元樣細胞、內(nèi)皮細胞)之精氣。

3.3 移植BMSCs與“熱毒”

上述研究大多關(guān)注補益藥物對BMSCs功能的影響，也包括對BMSCs移植后微環(huán)境改變和干細胞本身分化的作用。然而“干細胞移植”在中醫(yī)理論的概念中是沒有的，如果歸屬可能屬“外邪”范疇。由于移植后帶來排斥反應(yīng)的證候類似于溫病，因此也屬“熱毒”范疇。研究發(fā)現(xiàn)，具有解痘毒、消炎腫作用的木豆葉含藥血清對大鼠BMSCs有促增殖作用［46］。大黃苷元可使腦缺血再灌注損傷大鼠微血管基底膜 ColIV降解減少，通透性降低，并與BMSCs有協(xié)同作用，可使其早期的作用提前及中、后期作用增強，其作用機制可能與增加TIMP-1表達以調(diào)節(jié) MMP-9 和纖溶酶平衡有關(guān)［47、48］。這里的BMSCs與精、髓的關(guān)聯(lián)性都不大。

綜上所述，BMSCs在中醫(yī)理論中歸屬“精”、“髓”范疇。BMSCs轉(zhuǎn)分化為其他成體干細胞功能與先天之精化生后天之精類似。在此基礎(chǔ)上，衍生出“腦為髓之海”、“脾腎相關(guān)”、“精血同源”、“精氣互化”等。BMSCs主要來源于骨髓，是成骨細胞系的前體，與“髓生骨”較相同。因此，利用國際前沿的干細胞技術(shù)如BMSCs研究中醫(yī)相關(guān)理論，將為中醫(yī)研究打開新局面。

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