丙肝病毒基因組結(jié)構(gòu)及相關(guān)功能

張立營(yíng)，高博

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一種主要經(jīng)過血液傳播的肝炎病毒，是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要原因之一。目前人們對(duì) HCV 的致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不很清楚，也缺乏針對(duì) HCV 有效的治療方法及疫苗預(yù)防。近年來，通過對(duì) HCV 分子生物學(xué)的研究，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)以及相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物有了近一步的認(rèn)識(shí)。

HCV 屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈 RNA病毒，基因組全長(zhǎng) 9.6 kb，含有一個(gè)開放的編碼區(qū)，可編碼一個(gè)多聚蛋白前體，該蛋白前體由宿主和病毒的信號(hào)肽酶剪接成 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（核心蛋白、E1、E2）和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[1]。現(xiàn)就 HCV 基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的蛋白功能做一綜述。

1 非編碼區(qū)

1.1 5′非編碼區(qū)（5′UTR ）

5′UTR 包含 HCV 基因組 5′ 端的 341 個(gè)核苷酸。它是 HCV 基因組中最保守的區(qū)域，存在 3 個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)區(qū)，后兩區(qū)與病毒的進(jìn)化有關(guān)，前一區(qū)毗鄰病毒蛋白前體翻譯的真實(shí)啟動(dòng) AUG，對(duì) HCV 基因組的翻譯至關(guān)重要。5′UTR 存在內(nèi)部核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，核糖體與其結(jié)合啟動(dòng)翻譯過程[2]。

1.2 3′非編碼區(qū)（3′UTR）

3′UTR 位于 HCV 3′ 末端，由 22 ～ 55 個(gè)核苷酸組成，不編碼蛋白，能穩(wěn)定病毒生物學(xué)性狀，對(duì)病毒復(fù)制有調(diào)節(jié)作用。Friebe 等[3]研究發(fā)現(xiàn) 3′UTR 包括 1 個(gè)基因型特異的多變區(qū)（不同基因型之間具有核苷酸序列的差異）、多聚 U 區(qū)域（poly U）及 1 段高度保守的 98 個(gè)堿基的區(qū)域，稱為X-tail。不同基因型的 HCV 的多聚 U 區(qū)域有不同的長(zhǎng)度。

2 結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)

2.1 核心蛋白（HCV C）

HCV C 蛋白由 191 個(gè)氨基酸殘基組成，是 HCV 基因組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域，位于 HCV 基因組 342 ～914 nt 區(qū)段。HCV C 蛋白為病毒核衣殼的重要組成部分，與糖蛋白作用組裝出完整的 HCV 病毒顆粒。HCV C 蛋白氨基端富含堿性氨基酸且高度保守，其羧基端具有高度的疏水性[4]。C 蛋白通過與病毒 RNA 的結(jié)合來調(diào)節(jié) HCV 基因組的翻譯。體外研究顯示，它可通過與宿主蛋白的相互作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對(duì)原癌基因 c-myc、IL-2、勞氏肉瘤病毒（RSV）LTR、猿猴空泡病毒 SV40 早期啟動(dòng)子有激活作用，并且 HCV C 蛋白可抑制腫瘤抑制基因 p53 啟動(dòng)子的活性，與肝癌的發(fā)生相關(guān)[5-6]。此外，HCV C 蛋白的表達(dá)對(duì)于IFN-α 誘導(dǎo)的 STAT1 具有顯著的下調(diào)作用，HCV 感染所致的慢性肝病過程是 HCV C 蛋白對(duì)宿主肝細(xì)胞的多層面損傷及對(duì)干擾素抵抗等諸多因素作用的結(jié)果[7]。

2.2 包膜糖蛋白（envelope glycoproteins）

包膜區(qū)基因包括 E1 和 E2 兩部分，分別位于基因組的第 915 ～ 1490 nt 區(qū)段（E1）和 1491 ～ 2579 nt 區(qū)段（E2），分別編碼相對(duì)應(yīng)的兩種蛋白，構(gòu)成病毒的外膜[8]。E2區(qū) C端相對(duì)保守，N 端變異較大。N 端有兩個(gè)高變區(qū)，即 HVR1和 HVR2，前者較后者更易變異。通過對(duì) HVR1片段單鏈構(gòu)象多態(tài)分析，發(fā)現(xiàn) HCV 感染者體內(nèi)同時(shí)存在多種序列且有同源性的 HCV 變種，即類似株（準(zhǔn)種）。類似株的復(fù)雜性、多樣性與病情及肝損傷程度相關(guān)，HVR1類似株復(fù)雜程度越高，干擾素療效越差。包膜蛋白均為糖蛋白，含有中和性抗原表位，能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，由于該區(qū)中的 HVR1易變性，使新的變異株可逃避機(jī)體的免疫攻擊，致使 HCV 感染易慢性化，且給疫苗制造帶來困難[9-10]。因此研究包膜蛋白的抗原變異及宿主免疫應(yīng)答規(guī)律，對(duì) HCV疫苗的研究和開發(fā)有重要意義。

3 非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)（non-structural protein，NS）

3.1 NS1

NS1 基因編碼一段含有 63 個(gè)氨基酸的多肽 p7，位于HCV 基因組第 2580 ～ 2768 nt 區(qū)段。p7 介于結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白之間，有 2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)?？缒^(qū)通過 α-螺旋結(jié)構(gòu) 2 次跨膜，將 p7 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[11]。由于 HCV前體蛋白的加工是在宿主細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)上完成，因而膜定位作用對(duì)于非結(jié)構(gòu)蛋白的加工和成熟尤為重要，可能是其加工成熟的前提條件。Cao 等[12]最近的研究顯示，p7 的 CBL（conserved basic loop）是 3 個(gè)氨基酸組成的保守環(huán)結(jié)構(gòu)，具有離子通道活性，這種活性可被抗病毒藥物金剛烷胺抑制。Griffin 等[13]研究也證實(shí)，p7 蛋白在 HepG2 細(xì)胞內(nèi)可以形成六聚體，構(gòu)成離子通道，說明 p7 屬于病毒細(xì)胞外膜孔道蛋白家族（viroporin family），可能對(duì)于病毒的成熟和釋放極為重要，同時(shí)可以作為抗病毒治療的潛在靶位。

3.2 NS2

NS2 基因編碼由 216 個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白 p23，位于 HCV 基因組第 2769 ～ 3419 nt 區(qū)段。NS2 蛋白是1 個(gè)強(qiáng)疏水性跨膜蛋白，它的 C 末端轉(zhuǎn)運(yùn)至 ER 腔中，而氨基端位于細(xì)胞腔。NS2 作為 1 個(gè)跨膜蛋白，與 HCV 結(jié)構(gòu)蛋白 E1、E2 和非結(jié)構(gòu)蛋白如 NS5A、5B 都存在復(fù)雜的蛋白質(zhì)之間的相互作用。NS2 的主要功能尚不十分清楚，目前已知，NS2 的 C 末端和 NS3 的 N 末端緊密相連，形成一個(gè)具有酶活性的復(fù)合體，負(fù)責(zé) NS2/NS3 位點(diǎn)的切割，其作用方式主要為自身催化[14]。但 Ogata 等[15]研究認(rèn)為，在某些特定條件下 NS2 蛋白酶可以通過 Trans 方式介導(dǎo)裂解，實(shí)驗(yàn)中觀察到 EDTA 能抑制 NS2/NS3 蛋白酶的活性，而 Zn2+可將之激活，提示它可能為一種金屬蛋白酶（metallo-proteinase)。

3.3 NS3

NS3 基因編碼含有 631 個(gè)氨基酸的 p72 蛋白，位于基因組第 3420 ～ 5312 nt 區(qū)段，分子量約為 70 kD。它具有多種不同的生化功能，具有 NS2-3 蛋白酶活性、絲氨酸蛋白酶活性、RNA 解旋酶活性和 NTP 酶活性[16]。此外，NS3氨基端 120 個(gè)殘基與 HCV 相關(guān)腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。NS3 氨基端可和抑癌基因 p53 形成復(fù)合物，阻礙其基因功能，抑制放線菌素 D 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。Jhaveri 等[17]最近研究認(rèn)為 NS3 L106A 和 F43A位點(diǎn)突變可抑制絲氨酸蛋白酶活性，并阻礙 NS3-p53 復(fù)合物形成，可能成為抑制 HCV 復(fù)制及致癌性的新靶位。

3.4 NS4

NS4 基因位于 HCV 基因組第 5313 ～ 6257 nt 區(qū)段，其編碼的蛋白被加工處理為兩部分，即 NS4A 和 NS4B。S3 絲氨酸蛋白酶 cis 切割 NS3/NS4A，trans 切割 NS4A/NS4B 和 NS4B/NS5A。NS4A 長(zhǎng) 54 個(gè)氨基酸，分子量8 kD，N 端為疏水區(qū)，C 端為親水區(qū)。它具有多種功能，如作為復(fù)制復(fù)合體的錨定物以及 NS3 絲氨酸蛋白酶的輔助因子，NS4 中央?yún)^(qū)的疏水性氨基酸是其發(fā)揮 NS3 絲氨酸蛋白酶的輔助因子活性功能的重要部位。NS4B 位于基因組5475 ～ 6257 nt 區(qū)段，編碼 261 個(gè)氨基酸，是一種高度疏水的蛋白，至少 4 個(gè)跨膜區(qū)，是膜相關(guān)定位蛋白[18]。其主要作用包括抑制翻譯，調(diào)節(jié) NS5B RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）的活性，引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded proteinresponse,UPR）等。NS4B 主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的網(wǎng)狀改變，為病毒復(fù)制復(fù)合體的形成提供支架[19]。

3.5 NS5

NS5 基因位于 HCV 基因組 6528 ～ 9371 nt 區(qū)段，編碼的蛋白被加工處理為兩部分，即 NS5A 和 NS5B 蛋白。NS5A 蛋白位于基因組 6258 ～ 7601 nt 區(qū)段，編碼 448 個(gè)氨基酸，是高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)蛋白。NS5A 分布于細(xì)胞核膜周圍的胞漿。它有兩種形式：p56 和 p58。它們都是磷酸化蛋白，只是磷酸化的程度不同[20]。目前發(fā)現(xiàn)，它參與了HCV 多種蛋白的成熟和 RNA 復(fù)制，并調(diào)控宿主細(xì)胞多種基因表達(dá)，刺激細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡以及影響干擾素療效。NS5A 可激活多種轉(zhuǎn)錄因子如 NF-?β、STAT-3、SRCAP、PCNA 的活性，影響 p53 的功能，抑制內(nèi)源性和外源性p53 對(duì) p21 啟動(dòng)子的激活作用，阻礙其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。NS5A 還可抑制雙鏈 RNA 依賴蛋白激酶（ds RNA dependent protein kinase，PKR），使細(xì)胞增殖失控，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并能在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。NS5A 可影響 IFN-α 的應(yīng)答，是干擾素治療成功率低的原因之一[21]。目前，關(guān)于 NS5A 對(duì) IFN 應(yīng)答反應(yīng)的影響已成為研究的熱點(diǎn)。

NS5B 蛋白位于 HCV 基因組 7602 ～ 9371 nt 區(qū)段，它的序列高度保守，不僅在 HCV 株之間是保守的，而且在瘟病毒，黃病毒甚至其他 RNA 病毒中也是保守的。Hiscott等[22]研究證實(shí)，RNA 依賴的 RNA 聚合酶能在體外催化HCV RNA 產(chǎn)生雙鏈 RNA 發(fā)夾樣分子，這表明 NS5B 介導(dǎo)的 RNA 聚合酶通過還原拷貝機(jī)制，引發(fā)模板的延伸。雖然 NS5B 為病毒復(fù)制所必需的，但它并不能單獨(dú)完成 HCV的特異復(fù)制，必須有病毒和細(xì)胞蛋白參與，才能保證病毒自身復(fù)制的特異性。研究還表明 NS5B 可能還具有末端核酸轉(zhuǎn)移酶（TNTase）活性，它能將 UMP 摻入到 RNA 的 3′端，但考慮到不能排除蛋白提純的因素，目前不能完全證實(shí)NS5B 具有 TNTase 的活性。熊舒珺等[23]通過實(shí)驗(yàn)證明NS5B 基因可整合到轉(zhuǎn)染的 HepG-2 細(xì)胞的染色體上，并能有效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。體外 RNA 聚合酶試驗(yàn)和熒光素酶試驗(yàn)表明穩(wěn)定表達(dá)的 NS5B 在體外和細(xì)胞內(nèi)均具備 RNA 依賴的 RNA 聚合酶活性。

4 展望

綜上所述，HCV 病毒的分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)的研究已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，HCV 病毒所編碼的蛋白與病毒基因的復(fù)制、前體蛋白的加工、病毒的生命周期以及宿主細(xì)胞周期都有極為密切的關(guān)系。對(duì) HCV 分子生物學(xué)研究的不斷深入將為抗 HCV 藥物及針對(duì) HCV 的治療方法提供新的思路。在目前丙型肝炎防治工作處于困境的情況下，對(duì) HCV 各種結(jié)構(gòu)和酶功能的進(jìn)一步研究也許會(huì)給抗 HCV 藥物和疫苗的工作帶來某些意想不到的突破。

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