含人Fc重組凋亡融合蛋白體內(nèi)外抗腫瘤活性初步研究

羅嵐，劉洪洪，李祥，范開(kāi)

1995年Wiley 等[1]利用表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的方法在人心肌細(xì)胞 cDNA 文庫(kù)中鑒定出腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族凋亡誘導(dǎo)分子的一個(gè)新成員——腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL），TRAIL 通過(guò)與其相關(guān)受體結(jié)合，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。與 TNF 家族的另外 2 種凋亡誘導(dǎo)分子（TNF-α、Fas-L）相比，TRAIL 具有如下特點(diǎn)：①持續(xù)地表達(dá)于大多數(shù)正常細(xì)胞中，具有強(qiáng)大誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，且對(duì)正常細(xì)胞基本無(wú)影響；②比 Fas-L 具有更廣的抗癌譜；③對(duì)核因子NF-κB 僅有很微弱的激活作用，即使是全身用藥，也不會(huì)產(chǎn)生類似 TNF-α 的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。因此，TRAIL 被認(rèn)為是一種更為安全且極具潛力的抗腫瘤蛋白[2]。

TRAIL 重組蛋白主要利用大腸桿菌以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)復(fù)性、純化后得到含 Zn2+的三聚體活性結(jié)構(gòu)。目前，TRAIL 重組蛋白已進(jìn)入臨床研究階段，美國(guó) Amgen/gentech 公司研發(fā)的 TRAIL 重組蛋白產(chǎn)品已進(jìn)入 II 期臨床試驗(yàn)階段，在國(guó)內(nèi)相同 TRAIL 重組蛋白產(chǎn)品也已進(jìn)入 I、II 期臨床試驗(yàn)階段，研究結(jié)果顯示 TRAIL 重組蛋白聯(lián)合化療的抗腫瘤療效明顯，但半衰期較短[3]。為了進(jìn)一步證實(shí)其作用，我們對(duì) CHO 真核表達(dá)系統(tǒng)制備的含人抗體 Fc 片段的 TRAIL（TRAIL-Fc）重組融合蛋白在體內(nèi)外的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 TRAIL-Fc 重組融合蛋白凍干粉，1 mg/支，純度 95%，由 CHO 真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)制備，其中人 IgG 抗體 Fc 片段位于重組融合蛋白的 C 端，TRAIL 蛋白位于其 N 端，購(gòu)自重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司；TRAIL 對(duì)照品凍干粉，1 mg/支，純度 95%，由大腸桿菌表達(dá)制備，購(gòu)自深圳新鵬生物工程有限公司；5-氟尿嘧啶注射液（5-Fu），10 ml/0.25 g，購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；RPMI-1640、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Spectra MAX 190 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為美國(guó)Dynex公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞株 人急性 T 淋巴細(xì)胞白血病Jurkat 懸浮細(xì)胞、人結(jié)腸癌 LOVO 貼壁細(xì)胞、人胃癌 MKN45 貼壁細(xì)胞、人表皮癌 A431 貼壁細(xì)胞、人肝癌 HEPG2 貼壁細(xì)胞、人乳腺癌 MCF-7貼壁細(xì)胞均購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)和武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司傳代保存。其中 Jurkat 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中，其余細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 DMEM 完全培養(yǎng)液中，置于 37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

小鼠肝癌 H22 懸浮細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 BALB/C 小鼠 40 只，6～8 周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[合格證號(hào)：SYXK（渝）2002007]，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 SPF 級(jí)動(dòng)物房。

1.2 方法

1.2.1 體外抗腫瘤活性 采用 MTT 法檢測(cè)。調(diào)整 Jurkat 懸浮細(xì)胞、H22 懸浮細(xì)胞的密度為1×105個(gè)/ml，其余 5 種貼壁細(xì)胞 LOVO、MKN45、A431、HEPG2、MCF-7 分別用 0.25%的胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)分TRAIL-Fc 重組融合蛋白組、對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組各設(shè) 2 個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞均接種于 96 孔板中（100 μl 孔），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入含 1000、250、62.5、15.6、3.9、0.97 ng/ml TRAIL-Fc 重組融合蛋白和 TRAIL 對(duì)照品的完全培養(yǎng)液各 100 μl，同時(shí)以加入 100 μl 完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組。各組細(xì)胞經(jīng)不同處理后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，每孔加入 10 μl 濃度為5 mg/ml的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，貼壁細(xì)胞直接吸棄培養(yǎng)上清液，懸浮細(xì)胞離心后吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入 100 μl 的 DMSO，微量振蕩儀振蕩 5min，在 Spectra MAX 190 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔于波長(zhǎng) 570 nm 處的吸光度（A570）值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率（%）=（1 － 實(shí)驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570）×100%，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.2 體內(nèi)抗腫瘤活性 選取 H22 細(xì)胞分別行腹腔和腋下接種建立小鼠肝癌模型。調(diào)整 H22 懸浮細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，0.3 ml/只接種于BALB/C 小鼠腹腔內(nèi)，10 d 后抽取小鼠腹水，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，再分別對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔和腋下接種。待接種 3 d 后，據(jù)治療藥物的不同將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、5-Fu 組和 TRAIL-Fc重組融合蛋白組，每組 6 只，給藥途徑均為腹腔內(nèi)注射。其中空白對(duì)照組每只每天注射生理鹽水0.3 ml，5-Fu 組每只每天注射劑量為25 mg/kg，TRAIL-Fc 重組融合蛋白組每只每 3 天的注射劑量為10 mg/kg。

給藥后每天測(cè)量并記錄腹腔接種腫瘤小鼠的腹圍和體重，接種后第5 天開(kāi)始每天測(cè)量腋下接種腫瘤小鼠的腫瘤體積，腫瘤體積（TV）的計(jì)算公式為TV（mm3）= 1/2×a×b2，其中 a、b 分別表示腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑。接種后第15 天結(jié)束實(shí)驗(yàn)，摘除眼球取外周血后處死各組小鼠，剝?nèi)×鰤K稱重，計(jì)算抑瘤率，計(jì)算公式為抑瘤率（%）=（1 －實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/空白對(duì)照組平均瘤重）×100%。收集各組小鼠外周血，經(jīng)離心后獲取血清，送至重慶市九龍坡區(qū)第一人民醫(yī)院檢測(cè)血清中 AST 及ALT 含量，觀察肝臟功能損傷情況。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL-Fc 重組融合蛋白的體外抗腫瘤活性

以250 ng/ml TRAIL-Fc 重組融合蛋白處理腫瘤細(xì)胞 6～8 h 后，鏡下觀察顯示 7 種細(xì)胞均出現(xiàn)脫落變圓、胞質(zhì)皺縮、體積縮小等凋亡表現(xiàn)（圖1）。

對(duì) 7 種腫瘤細(xì)胞株的體外生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分別加入不同濃度的 TRAIL-Fc 重組融合蛋白后，所有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)（圖2）。其中對(duì) MCF-7 細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其最大生長(zhǎng)抑制率為82.5%；其次依次為L(zhǎng)OVO、MKN45、H22、Jurkat、HEPG2 細(xì)胞，其最大生長(zhǎng)抑制率分別為81.9%、52.3%、51.2%、50.9%、35.4%；而對(duì) A431細(xì)胞的抑制作用最弱，其最大生長(zhǎng)抑制率為20.3%。

TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì) 7 種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）結(jié)果顯示，與 TRAIL 對(duì)照品相比，TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì) LOVO、MKN45、MCF-7 細(xì)胞更敏感（表1）。

圖1 250 ng/ml TRAIL-Fc 重組融合蛋白體外作用 8 h 后LOVO 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 相差顯微鏡×100（A：TRAIL-Fc 重組融合蛋白組；B：空白對(duì)照組）Figure 1 Morphology of LOVO cells treated by 250 ng/ml TRAIL-Fc recombinant fusion protein for 8 h in vitro (Phasecontrast microscopemicroscopy, original magnification×100)(A: TRAIL-Fc recombinant fusion protein group; B: Blank control group)

圖2 MTT 法檢測(cè) TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì) 7 種腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用（A：MKN45 細(xì)胞；B：LOVO 細(xì)胞；C：MCF-7 細(xì)胞；D：HEPG2 細(xì)胞；E：Jurkat 細(xì)胞；F：A431 細(xì)胞；G：H22 細(xì)胞）Figure 2 The growth inhibition effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on 7 kinds of tumor cell lines by MTT method in vitro.A: MKN45 cells; B:LOVO cells; C: MCF-7 cells; D: HEPG2 cells; E: Jurkat cells; F: A431 cells;G: H22 cells.

2.2 TRAIL-Fc 重組融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性

接種 H22 細(xì)胞建立小鼠肝癌模型進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，腹腔接種 10 d 后，空白對(duì)照組小鼠腹水增加，腹部明顯膨出；TRAIL-Fc重組融合蛋白組小鼠腹部?jī)H輕微膨脹；5-Fu 組小鼠極度消瘦，腹部無(wú)膨脹。自給藥后每天測(cè)量各組小鼠體重，其中 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組小鼠體重維持較好，未見(jiàn)明顯變化；空白對(duì)照組小鼠后期體重略有下降；5-Fu 組小鼠體重急劇下降（圖3A、表2）。

表1 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì) 7 種腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制的敏感性Table 1 The sensitivities of TRAIL-Fc recombinant fusion protein to 7 kinds of tumor cell lines growth inhibition in vitro

圖3 H22 細(xì)胞荷瘤小鼠分別注射生理鹽水、5-Fu 和TRAIL-Fc 重組融合蛋白后的體重變化和腫瘤體積生長(zhǎng)曲線（A：腹腔接種后各組小鼠的體重變化曲線；B：腋下接種后各組小鼠的腫瘤體積生長(zhǎng)曲線）Figure 3 The curves of tumor volume and body weight of H22 celles tumor-bearing mice injected by normal saline, 5-Fu,or TRAIL-Fc recombinant fusion protein respectively.A: The curves of body weight of mice injected H22 celles into abdominal; B: The curves of tumor volume of mice injected H22 celles into armpit.

圖4 接種 15 d 后 H22 細(xì)胞腋下荷瘤小鼠瘤塊（每組 6 只）Figure 4 The tumor of mice injected H22 cells into armpit after 15-day (6 mice in each group)

H22 細(xì)胞腋下荷瘤小鼠，接種 5 d 后每天測(cè)量腫瘤體積，其中 5-Fu 組腫瘤體積明顯縮小，TRAIL-Fc 重組融合蛋白組腫瘤體積后期略有增加，空白對(duì)照組腫瘤體積持續(xù)顯著增加（圖3B）。接種 15 d 后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，剝?nèi)「鹘M小鼠瘤塊稱重并計(jì)算抑瘤率，其中 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組抑瘤率為45.79%，5-Fu 組小鼠未見(jiàn)瘤塊（圖4、表2）；取小鼠血清進(jìn)行 AST 和 ALT 檢測(cè)，結(jié)果顯示 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì)小鼠肝功能無(wú)明顯影響（表3）。

表2 接種 15 d 后 H22 細(xì)胞荷瘤小鼠的體重和瘤重（±s）Table 2 The body weight and tumor weight of H22 celles tumor-bearing mice after 15-day injection (±s )

表2 接種 15 d 后 H22 細(xì)胞荷瘤小鼠的體重和瘤重（±s）Table 2 The body weight and tumor weight of H22 celles tumor-bearing mice after 15-day injection (±s )

小鼠體重（g） Body weight of mice (g)組別Groups 實(shí)驗(yàn)前 Before experiment 實(shí)驗(yàn)后 After experiment瘤重（g）Tumor weight (g)空白對(duì)照組 Blank control group 18.18±1.08 17.33±1.42 3.21±0.61 5-Fu 組 5-Fu group 17.92±1.81 12.21±1.16 0 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組 TRAIL-Fc recombinant fusion protein group 17.64±0.69 16.48±1.62 1.74±0.46

表3 接種 15 d 后 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì) H22 細(xì)胞荷瘤小鼠肝功能的影響（±s）Table 3 The effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on H22 celles tumor-bearing mice liver function after 15-day injection (±s )

表3 接種 15 d 后 TRAIL-Fc 重組融合蛋白對(duì) H22 細(xì)胞荷瘤小鼠肝功能的影響（±s）Table 3 The effect of TRAIL-Fc recombinant fusion protein on H22 celles tumor-bearing mice liver function after 15-day injection (±s )

組別Groups AST (U/L) ALT (U/L)空白對(duì)照組Blank control group 16.00±1.84 7.00±0.42 5-Fu 組5-Fu group 38.00±6.01 47.00±5.73 TRAIL-Fc 重組融合蛋白組TRAIL-Fc recombinant fusion protein group 22.00±4.36 11.00±1.45

3 討論

TRAIL因具有廣泛誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用而對(duì)正常細(xì)胞基本無(wú)毒性的特點(diǎn)，而有望成為一種既有效又安全的腫瘤治療藥物。但已有報(bào)道 TRAIL對(duì)正常肝細(xì)胞有殺傷作用，如在體外大劑量 TRAIL重組蛋白（如 His-TRAIL[4]、用抗體鉸鏈的 FLAGTRAIL[5]）對(duì)新鮮分離的人原初肝細(xì)胞有毒性，而天然 TRAIL 對(duì)正常人肝細(xì)胞則無(wú)毒性[6]，這將有可能限制 TRAIL 重組蛋白的抗腫瘤臨床應(yīng)用。

與大腸桿菌表達(dá)的 TRAIL 重組蛋白相比，通過(guò) CHO 真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)制備的 TRAIL-Fc 重組融合蛋白具有更多的優(yōu)勢(shì)，如無(wú)需蛋白復(fù)性、具有天然 TRAIL 構(gòu)象、附有糖基化修飾等。同時(shí)通過(guò)與抗體 Fc 片段融合后其體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，減少了 TRAIL 可能帶來(lái)的肝細(xì)胞毒性。此外，由抗體Fc 片段介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）還可增強(qiáng) TRAIL 的體內(nèi)抗腫瘤作用。

在本研究中，體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRAIL-Fc 重組融合蛋白具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。分別加入不同濃度的 TRAIL-Fc 重組融合蛋白后，所有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)，其中抑制作用最強(qiáng)的是 MCF-7 細(xì)胞和 LOVO 細(xì)胞；并且所有細(xì)胞均出現(xiàn)脫落變圓、胞質(zhì)皺縮、體積縮小等凋亡表現(xiàn)，初步證實(shí)了該蛋白是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以每 3 天 1 次的給藥頻率，TRAIL-Fc重組融合蛋白能夠有效抑制小鼠腹腔及腋下荷瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。由此可推斷，通過(guò)與抗體 Fc 片段融合后，TRAIL 在體內(nèi)的半衰期明顯延長(zhǎng)。但有關(guān)TRAIL-Fc 重組融合蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡的具體作用機(jī)制，及其體內(nèi)最低有效劑量和半衰期等問(wèn)題，還有待進(jìn)一步研究。

[1]Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity, 1995, 3(6):673-682.

[2]Fan XG.T cells express TRAIL receptors.Immunol J, 2000, 16(4):316.(in Chinese)范學(xué)工.TRAIL受體的T細(xì)胞表達(dá).免疫學(xué)雜志, 2000, 16(4):316.

[3]Yee L, Fanale M, Dimick K, et al.A phase IB safety and pharmacokinetic (PK) study of recombinant human Apo2L/TRAIL in combination with rituximab in patients with low-grade non-Hodgkin lymphoma.J Clini Oncolo, 2007, 25(18):8078.

[4]Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Biol Chem, 1996, 271(22):12687-12690.

[5]Schneider P.Production of recombinant TRAIL and TRAIL receptor:Fc chimeric proteins.Methods Enzymol, 2000, 322:325-345.

[6]Ganten TM, Koschny R, Sykora J, et al.Preclinical differentiation between apparently safe and potentially hepatotoxic applications of TRAIL either alone or in combination with chemotherapeutic drugs.Clin Cancer Res, 2006, 12(8):2640-2646.