湘蕾金銀花提取物對馬鈴薯多酚氧化酶活性的影響

羅文娟，曾彪，田仁軍，龍桂友，彭國平

馬鈴薯是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，但馬鈴薯的多酚氧化酶（PPO）催化生成一系列色素物引起的褐變現(xiàn)象一直制約著馬鈴薯的開發(fā)利用[1-3]。金銀花（Lonicera japonicaThunb.）中含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素等不飽和化合物，其中的酚羥基結(jié)構(gòu)極易與自由基反應(yīng)，故具有顯著的抗氧化特性[4]。本文通過研究不同提取方法的金銀花提取物對馬鈴薯多酚氧化酶活性的影響，探尋馬鈴薯多酚氧化酶的天然抑制劑，為馬鈴薯深加工過程中防止褐變提供新的思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 湘蕾金銀花干品，產(chǎn)自湖南省隆回縣小沙江金銀花基地，經(jīng) 50℃干燥 48 h，粉碎至 40 目；馬鈴薯，市售。

1.1.2 試劑 無水乙醇購自湖南匯虹試劑有限公司，分析純。

1.1.3 儀器 UV-2100 雙光束紫外-可見分光光度為北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī) CR21G 為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 湘蕾金銀花提取物的制備

1.2.1.1 水提法：精確稱取 5.0 g 湘蕾金銀花粉末置圓底燒瓶中，加入 50 ml 蒸餾水回流提取 1 h。過濾后，濾渣再用 50 ml 蒸餾水提取 0.5 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至流膏狀。用 10 ml 熱蒸餾水洗出，4500×g離心10min，上清液定容至 20 ml，配制成含生藥 0.25 g/ml 的湘蕾金銀花水提物溶液，備用。

1.2.1.2 醇提法：以 70%乙醇為溶劑按照 1.2.1.1 法回流提取，配制成含生藥 0.25 g/ml 的湘蕾金銀花醇提物溶液，備用。

1.2.1.3 醇水結(jié)合提取法：將湘蕾金銀花曬干品粉末 5.0 g用 95%乙醇提取 1 h 后，濾渣再用 50 ml 蒸餾水提取0.5 h，過濾，合并兩次濾液，減壓濃縮至流膏狀。用 10 ml熱蒸餾水洗出，4500×g離心 10min，上清液定容至20 ml，配制成含生藥 0.25 g/ml 的湘蕾金銀花醇水結(jié)合提取物溶液，備用。

1.2.2 馬鈴薯多酚氧化酶（PPO）的提取 將 4℃下冷藏的馬鈴薯去皮，取塊莖 100 g，加 100 ml 經(jīng) 4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 6.8），用組織勻漿機(jī)打成勻漿。4 層紗布過濾，濾液 5600×g高速冷凍離心 10min，取上清液用蒸餾水定容至 50 ml，得馬鈴薯 PPO 粗酶液，置冰水浴中保存，備用[5]。

1.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性檢測 將 pH 6.8 磷酸緩沖液、 0.2 mol/L 鄰苯二酚及 PPO 液在 30℃的水浴中預(yù)保溫，在比色皿中依次加入 2.0 ml 的磷酸緩沖液、0.3 ml 的酶液、0.5 ml 濃度為0.2 mol/L 的鄰苯二酚溶液（空白對照為2.5 ml 的磷酸緩沖液、0.3 ml 的酶液），用 UV-2100 雙光束紫外可見分光光度計(jì)在 410 nm 處比色，每 2 秒計(jì)數(shù)一次，測得 1min 內(nèi)的 PPO 酶活動(dòng)力學(xué)特征曲線圖。

1.2.4 不同劑量的金銀花提取物對 PPO 動(dòng)力學(xué)影響的研究 在 1.2.3 中的反應(yīng)組和空白對照組中分別加入 0、10、15、20、25、30 μl 金銀花的 3 種提取物，按照上述測定方法，每 2 秒計(jì)數(shù)一次，記錄各時(shí)刻的 OD 值，將在相同時(shí)刻測得兩個(gè) OD 值相減，以時(shí)間為橫軸，OD 差值為縱軸作圖，得金銀花提取物對 PPO 活性影響的動(dòng)力學(xué)特征曲線。規(guī)定一個(gè)酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，單位時(shí)間內(nèi)引起吸光度改變 0.001 所需的酶量。以最初 10 s內(nèi)直線段的斜率（△OD/0.001 t）求酶活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05 為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 湘蕾金銀花提取物對 PPO 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響

三種湘蕾金銀花提取物對 PPO 活性影響的動(dòng)力學(xué)曲線（圖1～3）表明：多酚氧化酶氧化鄰苯二酚的反應(yīng)和產(chǎn)物的生成速度初始較快，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，PPO 的活性逐漸降低，這是由于生成的醌類物質(zhì)使多酚氧化酶活性受到抑制的結(jié)果，即存在反饋抑制作用。圖1 表明反應(yīng)體系中金銀花水提物對 PPO 酶活抑制作用存在劑量效應(yīng)；圖2表明不同劑量的金銀花醇提物對 PPO 酶活抑制效果差異不明顯；圖3 表明金銀花醇水結(jié)合提取物對 PPO 酶活抑制作用明顯，30 μl 醇水結(jié)合提取物對酶活抑制作用最強(qiáng)。

圖1 湘蕾金銀花水提物對 PPO 活性影響的動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 湘蕾金銀花醇提物對 PPO 活性影響的動(dòng)力學(xué)曲線

圖3 湘蕾金銀花醇水結(jié)合提取物對 PPO 活性影響的動(dòng)力學(xué)曲線

2.2 不同提取方法的湘蕾金銀花提取物對 PPO 活性影響的比較

SPSS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表1）表明，三種提取物對 PPO活性存在明顯抑制作用；三種提取方法獲得的提取物對PPO 活性抑制作用差異不顯著（P＞ 0.05）；水提取物和醇水混合提取物對 PPO活性抑制作用存在劑量效應(yīng)（P＜0.01），而醇提物對 PPO 活性抑制作用無劑量效應(yīng)（P＞0.05）。

表1 不同劑量的湘蕾金銀花 3 種提取物對 PPO 酶活抑制作用的影響

3 討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：湘蕾金銀花水提物、70%乙醇提取物、95%乙醇和水結(jié)合提取物對 PPO 活性均存在抑制作用，表明湘蕾金銀花含有多種 PPO 抑制成分，抑制強(qiáng)弱表明以水溶物中的 PPO 抑制劑較多，在 70%乙醇提取物中含量相對較少，根據(jù)筆者對湘蕾金銀花活性成分的提取經(jīng)驗(yàn)，70%乙醇提取組分多是黃酮類，95%乙醇與水提取的混合組分中成分較復(fù)雜，對 PPO 活性具有抑制作用的成分還有待進(jìn)一步探究。

[1]Li M, Guo YR, Chen DR, et al.Properties of polyphenol oxidase extracted from potato.J Gansu Agric Univ, 2005, 40(2):189-192.(in Chinese)李敏, 郭玉蓉, 陳德蓉, 等.馬鈴薯多酚氧化酶的特性研.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 40(2):189-192.

[2]Li XW, Xiong XY.Oxidation bleaching technics of potato starch.J Hunan Agric Univ (Nat Sci), 2006, 32(6):668-670.(in Chinese)李曉文, 熊興耀.馬鈴薯淀粉氧化漂白工藝研究.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 32(6):668-670.

[3]Wang ML, Hu ZL, Zhou MQ, et al.Advances in research of polyphenol oxidase in plants.Chin Bull Botany, 2005, 22(2):215-222.(in Chinese)王曼玲, 胡中立, 周明全, 等.植物多酚氧化酶的研究進(jìn)展.植物學(xué)通報(bào), 2005, 22(2):215-222.

[4]Ge B, Lu XY, Yi K, et al.The active constituent and pharmaceutical action of flos lonicerae and its application.Chin Wild Plant Resources,2004, 23(5):13-16.(in Chinese)葛冰, 盧向陽, 易克, 等.金銀花活性成分、藥理作用及其應(yīng)用.中國野生植物資源, 2004, 23(5):13-16.

[5]Meng Y, Li G, Cui Y, et al.The effect of extraction and purification condition on the activity of PPO from potato.Chem Bioeng, 2003,23(10):47-49.(in Chinese)孟雅, 李剛, 崔焱, 等.馬鈴薯多酚氧化酶的提取純化條件對其活性影響的研究.化學(xué)與生物工程, 2003, 23(10):47-49.