殼聚糖及其衍生物的抑菌試驗研究

盛貽林，葉舟，陳奇

殼聚糖（chitosan）為幾丁質(zhì)脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，是一種陽離子型多糖，也是目前唯一的商品化堿性多糖，具有無毒、可降解、良好的生物相容性、成膜性及抗菌抑菌等優(yōu)良特性，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品等方面得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。羧甲基殼聚糖是殼聚糖羧甲基化后的產(chǎn)物，既保留了殼聚糖的優(yōu)點，又極大地改善了水溶性，因而具有更廣泛的用途，在眾多的殼聚糖衍生物中倍受關(guān)注[3]。

大腸桿菌（Escherichia coli），枯草桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是自然界中普遍存在的細菌，也是食品中常見的細菌，對人體危害較大。目前食品中常用的防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鈉等，對人體都具有一定的危害。殼聚糖也可作為食品防腐劑，但是其水溶性不好，限制了它的應(yīng)用。羧甲基殼聚糖不僅具有防腐性能，而且還具有很好的水溶性[4]。

本文將殼聚糖、羧甲基殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用進行比較，以期為殼聚糖及其衍生物在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

殼聚糖和羧甲基殼聚糖購自山東奧康生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂和蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；牛肉膏購自杭州微生物制劑有限公司。大腸桿菌由金華市藥品檢驗所提供；金黃色葡萄球菌由金華市迪耳藥業(yè)有限公司提供；枯草芽孢桿菌由中科院微生物研究所提供。

牛津杯內(nèi)徑 6.0mm，外徑 7.8mm，高 10.0mm。DGG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱和 SHP-150 恒溫生化培養(yǎng)箱購自上海森信實驗儀器有限公司；LDZX-50KBS 高壓滅菌鍋購自上海申安醫(yī)療器械廠；BS-1EA 恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自常州國華電器有限公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖、羧甲基殼聚糖的抑菌試驗 將活化后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種至 LB 培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng) 24 h 后，分別制成 5‰、10‰ 濃度的菌液備用。在培養(yǎng)皿內(nèi)加入滅菌后的營養(yǎng)瓊脂，待冷卻凝固后分別加入 0.1 ml 5‰、10‰ 的菌液，用涂布器涂布均勻。每個平皿中均勻地放置無菌的牛津杯 3 只。將殼聚糖和羧甲基殼聚糖分別配制成 2.0、5.0、10.0、20.0 mg/ml 濃度的水溶液，用無菌吸管吸取上述不同濃度的殼聚糖和羧甲基殼聚糖溶液 0.25 ml 于牛津杯中。然后放入培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 24 h，觀察抑菌圈大小，測量抑菌圈平均直徑[5]。

1.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定 將羧甲基殼聚糖溶液加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中, 使終濃度分別為10.0、5.0、2.0、1.0、0.8、0.5、0.3、0.1 mg/ml，調(diào)節(jié) pH 值至 7.0，121℃滅菌 20min。將活化后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液稀釋成 5‰，每培養(yǎng)皿各加 0.1 ml，再加 15 ml 冷卻至 45℃的培養(yǎng)基，搖勻、冷卻后，37℃倒置培養(yǎng)，重復 2 次。以 24 h 后不長菌的濃度為最小抑菌濃度[5]。

1.2.3 不同 pH 值對羧甲基殼聚糖溶液抑菌性能的影響 制備羧甲基殼聚糖含量為5.0 mg/ml 的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用 10%的鹽酸或 10%氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以不加羧甲基殼聚糖的培養(yǎng)基為對照，121℃滅菌 20min，倒平板，冷卻后取 0.1 ml 三種菌懸液接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，均勻涂布，重復 2 次。37℃培養(yǎng) 24 h 后菌落計數(shù)，計算抑菌率。抑菌率 η =（N0－ N1）/N0（N0、N1分別為對照和加入羧甲基殼聚糖溶液的菌落數(shù)）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示。采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析和 Student-New man-Keuls 方法進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖的抑菌作用

殼聚糖難溶于水，其分散系為懸濁液，基本不能形成抑菌圈，少數(shù)在牛津杯的外接圓內(nèi)也長有菌落，結(jié)果見表1。

表1 殼聚糖的抑菌效果

2.2 羧甲基殼聚糖的抑菌作用

羧甲基殼聚糖對三種菌的抑菌作用見表2。經(jīng)方差齊性檢驗，顯示方差齊。說明羧甲基殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌作用，且對三種菌的抑菌作用有顯著性差異（P＜0.05），其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，對枯草芽孢桿菌的抑菌作用次之，對大腸桿菌的抑菌作用相對較弱。

表2 羧甲基殼聚糖的抑菌效果（±s）

表2 羧甲基殼聚糖的抑菌效果（±s）

抑菌圈直徑（mm）濃度（mg/ml） 金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌 大腸桿菌2.0 15.22±0.12 12.90±0.41 8.10±0.05 5.0 16.24±0.15 13.12±0.07 8.30±0.41 10.0 18.23±0.30 14.22±0.03 9.20±0.22 20.0 20.25±0.13 16.16±0.36 10.24±0.08

2.3 MIC 值的測定結(jié)果

試驗結(jié)果表明，羧甲基殼聚糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌最低抑菌濃度分別為0.5 mg/ml，0.8 mg/ml 和 2.0 mg/ml。由此可知，金黃色葡萄球菌對羧甲基殼聚糖的抑菌作用最為敏感，其次是枯草桿菌，大腸桿菌的敏感性較上述兩種細菌相對弱一些。

2.4 pH 值對羧甲基殼聚糖抑菌作用的影響

圖1 顯示羧甲基殼聚糖在 pH 5.5～6.0 范圍內(nèi)對大腸桿菌有很好的抑制作用，并隨著 pH 值的升高而降低。pH＜5.0 時由于環(huán)境過酸，未見或少見細菌生長；pH ＞ 6.0 時，羧甲基殼聚糖的抑菌作用明顯降低，但仍然有一定的抑制作用。

圖2 顯示羧甲基殼聚糖在 pH 5.0～6.5 范圍內(nèi)對枯草芽孢桿菌有明顯的抑菌作用，并隨著 pH 值的升高先降低再升高，至 pH 6.5 出現(xiàn)峰值，pH 值超過 6.5 開始明顯降低。pH＜5.0 時由于環(huán)境過酸，少見細菌生長；pH ＞ 7.0 時，羧甲基殼聚糖的抑菌作用明顯降低。

圖3 顯示羧甲基殼聚糖在 pH 5.5～6.5 范圍對金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，并隨著 pH 值的升高先降低再升高，至 pH 6.0 出現(xiàn)峰值，pH＜4.0 時由于環(huán)境過酸，少見細菌生長；pH ＞ 6.5 時，羧甲基殼聚糖的抑菌作用明顯降低。

圖1 pH 值對羧甲基殼聚糖對大腸桿菌抑菌作用的影響

圖2 pH 值對羧甲基殼聚糖對枯草芽孢桿菌抑菌作用的影響

圖3 pH 值對羧甲基殼聚糖對金黃色葡萄球菌抑菌作用的影響

3 討論

殼聚糖由于難溶于水，其分散系為懸濁液，基本不能形成抑菌圈。羧甲基殼聚糖對三種菌都有明顯的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，其次是枯草桿菌，對大腸桿菌的抑菌作用較上述兩種細菌相對弱一些。同時羧甲基殼聚糖的 pH 值對三種菌的抑菌作用也有一定的影響。

羧甲基殼聚糖的抑菌作用與氨基和分子大小有關(guān)，酸性環(huán)境有利于殼聚糖氨基的質(zhì)子化，質(zhì)子化殼聚糖進入菌體細胞內(nèi)，吸附結(jié)合一些帶負電的細胞質(zhì)，擾亂菌體細胞的正常生理代謝，從而抑制細菌生長?？梢?，適當?shù)乃嵝原h(huán)境對羧甲基殼聚糖的抑菌作用是必需的。

[1]Lu LF, Chen JG, Zheng LY.Antibacterial activity of chitooligosaccharides prepared by enzymolysis.J Food Sci Biotechnol,2008, 27(2):88-91.(in Chinese)盧玲妃, 陳建國, 鄭連英.酶法制備殼低聚糖對細菌的抑制作用.食品與生物技術(shù)學報, 2008, 27(2):88-91.

[2]Liu K, Hou BX, Yang SH, et al.Inhibition of bacteria by chitosan in vitro.J Modern Stomatol, 2007, 21(3):281-283.(in Chinese)劉琨, 侯本祥, 楊圣輝, 等.殼聚糖體外抑菌實驗研究.現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志, 2007, 21(3):281-283.

[3]Chen HF, Pan SR.Antibacterial activity ofcmC with different substition and molecular weights.China Pharmacist, 2008, 11(1):9-12.(in Chinese)陳浩凡, 潘仕榮.不同取代和分子量羧甲基殼聚糖抑菌活性的測定.中國藥師, 2008, 11(1):9-12.

[4]Teng LJ, Zhang ZY , Tang SZ , et al.Antibacterial study of chitosan.China Condiment, 2008(10):48-51, 55.(in Chinese)滕麗菊, 張子勇, 唐書澤, 等.殼聚糖的抗菌活性研究.中國調(diào)味品, 2008(10):48-51, 55.

[5]Yu YM, Mao SG, Sun JD.Inhibition on anti- ampicillin E.coli strain by enzymatic solutions of chitosan.J Shenyang Agric Univ, 2006,38(3):422-424.(in Chinese)于艷敏, 毛勝剛, 孫軍德.殼聚糖酶解液對抗藥性大腸桿菌的抑制作用.沈陽農(nóng)業(yè)大學學報, 2006, 38(3):422-424.