應用凝集素芯片檢測細胞膜表面糖鏈種屬特異性

馬汝海，王天驕，潘忠誠，何群

細胞膜表面糖復合物在構(gòu)建復雜的多細胞器官和生物體中擔任特別重要的角色，參與細胞之間以及細胞與其基質(zhì)之間的相互作用，這些相互作用是多細胞生物發(fā)育和生物功能的關鍵環(huán)節(jié)[1]。

多細胞的個體發(fā)育和各種類型細胞的活化與聚糖結(jié)構(gòu)改變有著密切聯(lián)系，基于這一方面已經(jīng)有大量文獻報道。人們已經(jīng)意識到在哺乳動物胚胎發(fā)育以及細胞活化過程中會發(fā)生細胞表面的糖基化改變，認為糖基化可參與細胞黏附、受體活化、細胞分化以及組織形態(tài)發(fā)生。但是關于在不同的相關物種中，相同糖蛋白是否具有相同類型的糖基化、相同的組織細胞膜是否具有相同類型的糖鏈這方面報道尚不多。

凝集素（lectin）是一類糖結(jié)合蛋白，能專一地識別單糖或寡糖中特定的糖基序列并與之結(jié)合，常用于寡糖和糖復合物的分離純化和糖鏈的結(jié)構(gòu)分析[2]。在本研究中，我們用構(gòu)建的凝集素芯片分別對小鼠和兔的細胞膜表面糖鏈類型進行了檢測，提取相同組織細胞并進行熒光標記，利用凝集素與糖鏈的親和性捕獲細胞，激光掃描儀掃描檢測捕獲細胞的凝集素位點，根據(jù)捕獲得到的細胞膜表面糖鏈與凝集素特異親和性的不同確定不同組織細胞膜的糖鏈類型[3]，以探求不同物種間相同組織細胞膜的糖鏈特異性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性健康 C57 小鼠，均為6 周齡，體重 20～24 g；雌性健康大耳白兔，均為13 周齡，平均體重 2100 g。小鼠和白兔均購自于中國醫(yī)科大學實驗動物部，飼養(yǎng)條件均符合國家SPF 級標準。

1.1.2 試劑 凝集素、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、戊二醛均購自美國 Sigma 公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；紅細胞裂解液（ELS）、HE 染色液和吖啶橙購自北京賽馳生物科技有限公司；硅烷耦聯(lián)劑（3-氨丙基三甲氧基硅烷）SCA-1103 購自國泰華榮化工新材料有限公司。

1.1.3 儀器 MGⅡ600 生物芯片點樣儀為英國BioRobiotics 公司產(chǎn)品；Gene TACTMLS IV 激光掃描儀為美國 Genomic Solutions 公司產(chǎn)品；低溫離心機為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；ECLIPSE 80i 熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 凝集素芯片的制備 凝集素芯片的具體制備方法參考文獻[3]。選擇 22 種凝集素，利用MicroGridⅡ600 生物芯片點樣儀在芯片上制備凝集素點陣（圖1），每個位點均設 2 個平行點。選用 BSA 為陰性質(zhì)控，選用馬鈴薯凝集素（STL）為陽性質(zhì)控。點樣后將芯片置于 37℃濕盒內(nèi)水化30min，4℃冰箱存儲備用。凝集素及其糖鏈親和特異性見表1。

1.2.2 組織細胞懸液的制備 無菌條件下分別取10 只 C57 小鼠和 5 只大耳白兔的肝、脾、腎組織，以含有肝素的 D-hank 液清洗后剪碎，加入濃度為0.25%的膠原酶 IV，37℃水浴消化 1 h，170×g離心 8min，棄上清，加入紅細胞裂解液去除紅細胞，170×g離心 5min，收集沉淀，D-hank液重懸細胞，加入吖啶橙染色 5min，170×g離心5min，棄上清，以 RPMI 1640 培養(yǎng)液洗滌 2 次，并調(diào)整細胞的終濃度為1×105個/ml。

圖1 凝集素芯片布陣圖Figure 1 Layout of lectin microarray

1.2.3 凝集素親和性檢測 取出點樣制備的凝集素芯片，37℃濕盒內(nèi)水化 15min，加入濃度為0.5%的酪蛋白溶液（含 0.01 mol/L PB，pH7.2）封閉 5min，再以 0.01 mol/L 的 PB 緩沖液（pH7.2）洗滌 5min 后吹干。將制備的細胞懸液分別滴加至芯片上，37℃孵育 40min，以 0.01 mol/L PBS（pH 7.2）緩沖液洗滌 5min，加入濃度為3%的戊二醛（含 0.01 mol/L PBS，pH 7.2）固定 10min。Gene TACTMLS IV 激光掃描儀檢測芯片中各凝集素位點的熒光信號強度，行 HE 染色后于 ECLIPSE 80i熒光顯微鏡下觀察各凝集素位點所捕獲的細胞形態(tài)。

1.2.4 不同膠原酶消化的影響 制備組織細胞懸液時，分別用 0.25%的膠原酶 I、II 代替膠原酶Ⅳ 對組織進行消化，同樣利用凝集素芯片檢測各凝集素位點的熒光信號強度，觀察不同膠原酶消化對檢測結(jié)果的影響。

表1 凝集素的組織來源及其糖鏈親和特異性Table 1 Tissue origin and glycoprofiles binding specificities of lectins

2 結(jié)果

2.1 小鼠和兔肝、脾、腎細胞膜表面糖鏈的凝集素芯片檢測

對 10 只小鼠和 5 只大耳白兔不同組織細胞膜表面糖鏈檢測的結(jié)果顯示，小鼠和兔相同組織細胞膜表面糖鏈類型基本相同，僅個別凝集素位點略有不同。其中，在 GNA、LTL、HHL、NPL 位點，兔脾細胞檢測結(jié)果均為陰性，小鼠脾細胞檢測結(jié)果均為陽性。在 BPL、WFA 位點，兔腎細胞檢測結(jié)果均為陰性，小鼠腎細胞檢測結(jié)果均為陽性；而在MAL-I 位點，兔腎細胞檢測結(jié)果為陽性，小鼠腎細胞檢測結(jié)果為陰性。在 MPL、WBA、LTL、SBA、BPL、WFA、MAL-I、AAL、BCL 位點，兔肝細胞檢測結(jié)果均為陽性，小鼠肝細胞檢測結(jié)果均為陰性；而在 NPL 位點，小鼠肝細胞檢測結(jié)果為陽性，兔肝細胞檢測結(jié)果為陰性。在 DSL、STL 位點，小鼠和兔各組織細胞檢測結(jié)果均為陽性；而在EEL、DBA 位點，小鼠和兔各組織細胞檢測結(jié)果均為陰性（表2、圖2）。

表2 小鼠和兔肝、脾、腎組織細胞膜表面糖鏈的凝集素芯片檢測結(jié)果Table 2 The test results of glycoprofiles on the liver,spleen, kidney tissue cells surface of mice and rabbits by lectin microarray

2.2 不同膠原酶消化對檢測結(jié)果的影響

在 GNA 位點，兔脾組織分別經(jīng) 3 種膠原酶消化后捕獲的細胞數(shù)目存在差異，經(jīng)膠原酶 II 消化后可見極少量細胞，而經(jīng)其他兩種膠原酶消化后則未見捕獲細胞。兔腎組織以及小鼠的脾和腎組織經(jīng)不同膠原酶消化后，檢測結(jié)果無明顯差異，僅個別凝集素位點捕獲細胞數(shù)略有差別。在 BCL 位點，兔肝組織經(jīng)膠原酶 IV 消化后捕獲細胞最多，經(jīng)膠原酶 II 消化后捕獲細胞較少，經(jīng)膠原酶 I 消化后僅捕獲少量細胞。上述結(jié)果提示不同膠原酶消化可影響細胞膜表面?zhèn)€別糖鏈的特性。

3 討論

細胞膜表面含有豐富的糖復合物，在細胞連接、細胞識別、免疫應答、信號傳遞中起著重要作用。在細胞識別方面，這些糖復合物具有兩類生物學功能：①被同一個體的內(nèi)源受體所識別；②被其他生物體所識別，多數(shù)病原生物體必須要首先通過識別靶細胞表面的聚糖序列從而結(jié)合靶細胞。糖復合物的這兩類識別功能必然受到不同類型和速率的進化選擇壓力，在有些種內(nèi)和種間存在糖基化變異，其中比較典型者即為ABO 血型系統(tǒng)[4-5]。

凝集素芯片的建立為細胞膜表面糖鏈的通量、快速檢測建立了一個平臺[6-8]。本實驗選擇了 22 種凝集素制備凝集素芯片，對小鼠和兔的脾、腎、肝組織細胞膜表面糖鏈進行通量檢測，為了避免年齡引起的細胞膜糖鏈的差異，本實驗選用的均為6 周齡小鼠和成年大耳白兔。檢測結(jié)果顯示，小鼠和兔相同組織的細胞膜表面糖鏈類型基本相同，提示相同組織細胞膜表面糖鏈具有其保守性，這可能與組織分化及其功能密切相關。但小鼠和兔相同組織細胞膜表面糖鏈也存在其特異性，對于兔脾細胞，在 LTL（α-L-Fuc）、GNA（α1, 3Man not Glc）、HHL（α1, 3Man）和 NPL（α1, 6Man）位點均為陰性，而小鼠脾細胞在這些位點的檢測結(jié)果均為陽性，提示小鼠脾細胞膜表面含有少量的甘露糖糖鏈成分，兔脾細胞則沒有。兔腎細胞只有在 DSL、AAL、MAL-I、STL 位點均為陽性，對應凝集素的糖鏈親和特異性，兔腎細胞膜表面糖鏈以 GlcNAc為主；而小鼠腎細胞在 DSL、BPL、WFA、AAL、STL 位點均為陽性，對應凝集素的糖鏈親和特異性，小鼠與兔腎細胞膜表面的共有糖鏈為GlcNAc；此外，小鼠腎細胞膜表面還表達 GalNAc 型糖鏈，兔腎細胞在 MAL-I（Glcβ1, 4GalNAc）位點為陽性，提示小鼠和兔腎細胞膜表面 GalNAc 型糖鏈在末端支鏈細節(jié)存在差別。小鼠和兔的肝細胞膜表面糖鏈類型差異較大，兔肝細胞表面呈現(xiàn)大量的GalNAc 型糖鏈和巖藻糖糖鏈，而小鼠肝細胞表面GalNAc 型糖鏈呈陰性，但有 Man 型糖鏈表達。STL 與 GlcNAc 型糖鏈具有特異的親和性，GlcNAc化蛋白是細胞骨架蛋白，參與細胞骨架和膜結(jié)構(gòu)，在本實驗中我們將 STL 作為陽性對照，檢測結(jié)果顯示，所有組織細胞在 STL 位點檢測均為陽性，證實了這些組織細胞膜表面共表達 GlcNAc 型糖蛋白。而在作為陰性質(zhì)控的無糖鏈特異親和性的BSA 位點，所有組織細胞的檢測結(jié)果均為陰性。

α1, 3Gal 抗原表位是由 2-型糖脂與對應糖蛋白在特異的 α1, 3 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下合成而成，但該抗原及與其對應的 α1, 3 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在包括人類在內(nèi)的舊大陸靈長類的細胞和組織中多數(shù)不存在。在本實驗中，小鼠和兔各組織細胞膜表面糖鏈的檢測結(jié)果顯示，兩者在 EEL 凝集素位點均為陰性，證實了小鼠和兔各組織細胞膜表面無 α1, 3Gal 糖鏈表達。

不同物種同一類型細胞膜表面相同糖鏈結(jié)構(gòu)的固定表達可意味其重要的內(nèi)源性功能，而糖鏈結(jié)構(gòu)的變異也可能與種群免疫相關[9]。了解不同物種之間同一類型細胞膜表面糖復合物的差異，可更加系統(tǒng)地進行糖生物學比較，對于預測內(nèi)源聚糖的功能、糖復合物在種群之間的免疫識別有一定幫助。

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