擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1的獲得及表型分析

戴文懿， 孫亞梅， 高 貝， 周樹敏， 袁曉君， 韋嘉勵(lì)， 張 衛(wèi)

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200444)

植物由于無法自由移動(dòng)，因此必須在進(jìn)化過程中發(fā)展一系列能力來適應(yīng)多變的環(huán)境因素以繁衍后代.對(duì)植物生長(zhǎng)繁殖影響重大的環(huán)境因素主要有溫度、光周期、光強(qiáng)、光質(zhì)、濕度、土壤中的水分和養(yǎng)分等［1-4］.目前，在環(huán)境因素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育控制或影響的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，進(jìn)展最快的是利用模式植物水稻和擬南芥進(jìn)行的研究，其中水稻作為最重要的農(nóng)作物之一，已在水分或養(yǎng)分的缺乏、鹽脅迫等對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，以及光照對(duì)植物開花控制等方面獲得了重要的研究進(jìn)展.溫度是影響植物生長(zhǎng)繁殖最重要的環(huán)境因素，早先人們對(duì)溫度影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究集中在植物如何抵御極端溫度(低至冰點(diǎn)溫度以下，高至40℃以上)的傷害方面，并且對(duì)于起源于寒溫帶植物的春化現(xiàn)象也有了突破性的進(jìn)展［5］.近幾年，對(duì)于非極端溫度以外的常溫(或者非脅迫溫度)對(duì)植物各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期影響的研究也取得了一定的進(jìn)展.Weigel實(shí)驗(yàn)室率先對(duì)常溫下若干擬南芥開花突變體的表型進(jìn)行了觀察，并探討了一些控制開花的關(guān)鍵基因在不同溫度下的轉(zhuǎn)錄表達(dá).他們發(fā)現(xiàn)，像FT等控制開花的關(guān)鍵基因在低溫16℃和常溫23℃下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著不同;自主途徑控制開花基因，如FCA等，在介導(dǎo)溫度變化對(duì)擬南芥開花的影響方面起著主導(dǎo)作用［6-10］.Kumar等［11］發(fā)現(xiàn)某種類型的核小體組蛋白可以感知外界溫度的變化，并在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控植物適應(yīng)外界溫度條件的變化.這些研究進(jìn)展，預(yù)示著常溫控制植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究可能在近期會(huì)有重大突破.

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)非脅迫范圍內(nèi)的溫度，即常溫變化敏感的雄性不育作物已經(jīng)被廣泛用于雜交作物的生產(chǎn)中［12］.以雜交水稻為例，目前在我國(guó)的超級(jí)雜交稻生產(chǎn)中，育性轉(zhuǎn)換臨界溫度低的溫敏雄性不育系已經(jīng)作為主要的雄性不育系被廣泛用于雜交稻的制種.這類溫敏雄性不育系在較低溫下可育，而在常溫(即指適合水稻生長(zhǎng)發(fā)育的溫度范圍)和高溫下不育，因而在常溫下被用于雜交制種，而在低溫下用于育性恢復(fù)、自交繁殖不育系的種子.在作物雜交優(yōu)勢(shì)利用中，溫敏雄性不育系具有無需保持系、幾乎可以任意選擇恢復(fù)系、制種術(shù)簡(jiǎn)便、較易選配出優(yōu)良的雜交組合等優(yōu)點(diǎn).但是，這類溫敏核不育水稻存在育性漂移的問題［5，12］，并且在目前所有的雜交作物中，尚未有溫敏雄性不育基因克隆鑒定的報(bào)道，也不清楚育性調(diào)控的分子基礎(chǔ)，這些都極大制約了對(duì)溫敏雄性不育系的開發(fā)利用.

擬南芥作為模式植物的優(yōu)良特性已為廣大植物遺傳學(xué)的研究者所共識(shí).從目前雄性不育領(lǐng)域的研究發(fā)展來看，水稻和擬南芥在該領(lǐng)域具有非常相近的遺傳學(xué)途徑和基因組分，因此，利用擬南芥開展溫敏雄性不育的研究可能是非常好的突破口.本實(shí)驗(yàn)室篩選到了1株經(jīng)甲基磺酸乙酯(EMS)化學(xué)誘變的擬南芥溫敏雄性不育突變體atms1，并就不同溫度對(duì)其育性和花粉花藥形態(tài)學(xué)等方面的影響進(jìn)行了研究.

1 材料和方法

1.1 材料來源

野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)為生態(tài)型Columbia(Col-0)，擬南芥atms1為本實(shí)驗(yàn)室用EMS誘變得到的溫度敏感雄性不育株系.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物種植

擬南芥種子播種在V(黑土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶6∶0.25的混合土中，4℃春化2～4 d后，以塑料薄膜覆蓋;然后，在20℃，濕度為60%～70%，光照強(qiáng)度為50 μEm-2·s-1，16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)，種子萌發(fā)后揭去薄膜;待植物抽薹后移至人工氣候培養(yǎng)箱中，分別以16，23和27℃3種溫度培養(yǎng)10 d.

1.2.2 花藥育性觀察

待擬南芥抽薹后分別放到16，23和27℃的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后每隔3 d取一次花，約3～6朵，共取3次.用亞歷山大染色方法染色固定，觀察花粉育性.

1.2.3 石蠟切片

取花序中不同發(fā)育時(shí)期的花苞，用FAA固定液固定，經(jīng)乙醇系列脫水和二甲苯透明后，浸蠟并包埋，用旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)做連續(xù)橫切片，切片厚度為4～6 μm，硼酸-甲苯胺藍(lán)染色，中性樹膠封片.在LEICA DM2500光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.4 植物果莢觀察方法

按V(冰乙酸)∶V(酒精)∶V(丙三醇)=1∶1∶1的比例混合配置透明液，將果莢放入透明液中煮沸，約10 min后將果莢取出觀察.

1.2.5 突變體的背景純化與遺傳分析

以擬南芥野生型Col-0為父本，突變體為母本進(jìn)行回交得到F1代，F(xiàn)1代自交后得到F2代.種植并觀察F2代表型，統(tǒng)計(jì)F2代中可育植株與不育植株的比例.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 atms1的可見表型觀察和育性分析

atms1是經(jīng)化學(xué)誘變劑EMS誘導(dǎo)擬南芥野生型Col-0種子，并從建立的突變體庫中篩選得到的雄性不育植株，它與野生型擬南芥(以下簡(jiǎn)稱野生型)的形態(tài)學(xué)比較如圖1所示，育性分析比較如圖2所示.當(dāng)環(huán)境溫度為23℃時(shí)，野生型植株正常生長(zhǎng)，生長(zhǎng)40 d抽薹后的atms1與野生型相比在整株形態(tài)上沒有顯著差異(見圖1(a)).從果莢來看，野生型的果莢大，種子發(fā)育全部正常(見圖1(d))，而atms1的果莢小于野生型，且種子發(fā)育出現(xiàn)空癟現(xiàn)象，如圖1(f)的箭頭所示.雄蕊中部分花絲比野生型短小，花器官解剖結(jié)果如圖1(h)和圖1(i)所示.亞歷山大染色及育性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：野生型花粉粒的不育率接近0，而atms1花粉粒的不育率約為40%(見圖2(b)、圖2(d)和圖2(e)).當(dāng)野生型的花粉和atms1的雌蕊雜交后，atms1產(chǎn)生了肥大的果莢，形態(tài)大小和23℃環(huán)境中生長(zhǎng)的野生型植株產(chǎn)生的果莢無明顯差別，內(nèi)有30～40粒種子.這些結(jié)果說明該atms1是雄性不育，并且只是部分雄性不育.

在27℃培養(yǎng)10 d后，野生型仍能產(chǎn)生正常果莢，但atms1產(chǎn)生的果莢短小且內(nèi)無正常種子(見圖1(g)).通過對(duì)花藥的進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)atms1的花藥與野生型相比，顏色呈黃褐色且表面光滑無花粉粒(見圖1(b)和圖1(c))，而且atms1的雄蕊花絲較短，使得雄蕊的花藥無法與雌蕊的柱頭觸碰(見圖1(j)).亞歷山大染色育性統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：野生型花粉粒的育性基本正常，atms1花粉粒的不育率達(dá)到80%左右(見圖2(c)和圖2(f)).此外，當(dāng)把a(bǔ)tms1從23或27℃移到16℃的環(huán)境條件下培養(yǎng)1周后，植株又能結(jié)出正常果莢(見圖1(e))，且花粉粒染色及育性統(tǒng)計(jì)結(jié)果與野生型相同(見圖2).

圖1 野生型與atms1的植株、花藥、果莢和花的形態(tài)學(xué)比較Fig.1 atms1 plant，anther，silique and flower compared with wild type

圖2 野生型和atms1在不同溫度下的花粉育性統(tǒng)計(jì)和花藥圖Fig.2 atms1 pollen fertility statistics and anther compared with wild type

2.2 不同溫度下atms1花藥的發(fā)育

花藥發(fā)育是一個(gè)非常精細(xì)復(fù)雜的過程，受到多種基因的調(diào)控.Paul等［13］將花藥發(fā)育分為14個(gè)時(shí)期.花藥在不同發(fā)育時(shí)期具有特定的組織結(jié)構(gòu)特征以及細(xì)胞學(xué)特征.通過對(duì)不同環(huán)境溫度條件下atms1花藥發(fā)育的研究顯示：當(dāng)環(huán)境溫度為16℃時(shí)，atms1花藥發(fā)育的14個(gè)時(shí)期與野生型表型相同，花藥發(fā)育完全正常;在環(huán)境溫度為23和27℃條件下處理10 d后，在花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂前，atms1與野生型花藥的發(fā)育未出現(xiàn)差異，而當(dāng)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后，atms1的花藥發(fā)育出現(xiàn)明顯的差異.23℃處理10 d后，atms1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后的表型與野生型花藥相似(見圖3(a)～圖3(j)).27℃處理10 d后，atms1花藥中花粉母細(xì)胞胼胝體和野生型相比明顯單薄(見圖3(k)).雖然atms1的花粉母細(xì)胞也能分裂產(chǎn)生四分體(見圖3(l))，但是到了單核花粉粒階段，atms1花藥的絨氈層明顯比野生型肥厚，且在絨氈層細(xì)胞中出現(xiàn)大液泡，如圖3(m)箭頭所示.在雙核花粉粒階段，atms1的絨氈層仍處于肥厚且含大液泡的狀態(tài)(見圖3(n))，而野生型的絨氈層此時(shí)已退化，并形成致密的一圈(見圖3(d)).同時(shí)在此發(fā)育階段，atms1中同一朵花的各個(gè)花藥所處的發(fā)育時(shí)期也出現(xiàn)顯著差異，甚至同一個(gè)花藥的4個(gè)花藥室的發(fā)育都不同步.正常條件下，當(dāng)花藥發(fā)育到成熟花粉期，野生型的花藥壁開裂，大量花粉粒被釋放(見圖3(e)).但在23℃處理10 d后，atms1產(chǎn)生的花粉粒較少，且有少量的花粉粒敗育，如圖3(j)箭頭所示;而27℃處理10 d后，atms1的絨氈層在該時(shí)期尚未完全降解，花藥中還殘存少量絨氈層細(xì)胞，如圖3(o)箭頭所示.由于atms1花藥絨氈層的發(fā)育明顯滯后于同時(shí)期的野生型花藥，導(dǎo)致其不能產(chǎn)生正常的花粉粒，從而影響到授粉、受精等后續(xù)事件的正常進(jìn)行，進(jìn)而影響了植株的育性.

圖3 野生型和atms1的花藥發(fā)育Fig.3 Development of anthers in atms1 compared with wild type

隨著溫度的升高，atms1花藥絨氈層發(fā)育的滯后性越來越嚴(yán)重，23℃時(shí)僅有小部分絨氈層發(fā)育滯后，所以atms1表現(xiàn)為半不育;而在27℃時(shí)，幾乎所有的絨氈層均表現(xiàn)為發(fā)育滯后，植株不能產(chǎn)生正常成熟的花粉粒，進(jìn)而導(dǎo)致atms1幾乎完全不育.

2.3 atms1的遺傳背景純化與遺傳分析

atms1與野生型Col-0回交后，F(xiàn)1代表型正常，植株可育，說明該突變體受隱性基因控制.F1代自交得到的F2代群體中出現(xiàn)育性分離，在27℃時(shí)，可育植株164株，不育植株56株.經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，二者比例為3∶1，符合孟德爾遺傳定理，因此，可以初步確定突變體atms1的溫敏雄性不育表型受單個(gè)隱性核基因控制.

3 討論

目前，非脅迫溫度(常溫)敏感型雄性不育系在雜交作物生產(chǎn)中起著越來越重要的作用，鑒定控制這類雄性不育的基因，并且探究其作用機(jī)理具有重要的科學(xué)意義和巨大的應(yīng)用前景，但是目前仍然沒有任何一種作物的常溫敏不育基因被克隆鑒定.模式植物擬南芥中，目前只有myb33/myb65雙突變體具有常溫敏雄性不育特征的報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)室分離到的溫敏雄性不育突變體atms1的育性變化正是屬于該范疇：在相對(duì)于擬南芥的低溫16℃培養(yǎng)時(shí)，atms1表現(xiàn)出和野生型幾乎一致的可育性;在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)溫度(23℃)時(shí)，atms1的花粉不育率上升為40%，而其果莢的育性降為60%;在高溫27℃時(shí)，atms1的花粉不育性上升至80%，果莢則接近完全不育.

與野生型相比，當(dāng)溫度低于23℃時(shí)，atms1的花藥沒有顯著的表型，而當(dāng)溫度升高至27℃時(shí)，atms1的花藥也出現(xiàn)了顯著的表型：其絨氈層發(fā)育與同時(shí)期的野生型相比要滯后;有些花藥室的絨氈層在花藥壁破裂時(shí)仍然保持不降解;atms1花粉母細(xì)胞的胼胝體單薄，細(xì)胞形狀扭曲，個(gè)別細(xì)胞開始有降解的跡象;atms1花藥的各個(gè)花藥室發(fā)育不同步.由于絨氈層對(duì)花粉發(fā)育至關(guān)重要，許多絨氈層發(fā)育突變體都有花粉母細(xì)胞、或者晚期的小孢子、或者更晚期的花粉在發(fā)育過程中逐漸降解的表型.27℃時(shí)atms1的花藥切片結(jié)果顯示，其絨氈層發(fā)育時(shí)期明顯滯后于花粉發(fā)育時(shí)期，這種表型與myb33/myb65雙突變體非常相似.綜合atms1花粉和花藥的表型，可以判斷atms1的基因突變所導(dǎo)致的缺陷影響的是絨氈層的發(fā)育，因此atms1是一個(gè)絨氈層發(fā)育的突變體.

關(guān)于受外界環(huán)境溫度控制和影響植物生殖能力變化方面的研究，目前還處于起步階段，有關(guān)的基因克隆鑒定十分罕見，即使是基礎(chǔ)研究進(jìn)展最快的擬南芥研究，至今已見報(bào)道的也只有3個(gè)溫敏雄性不育基因被克隆鑒定.2009年，De Ye實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種擬南芥高溫敏感雄性不育突變體tms1［14］.他們發(fā)現(xiàn)，tms1在常規(guī)溫度下育性表現(xiàn)和野生型并無不同，而在脅迫高溫30℃下處理2 d后，其育性急劇下降.正如預(yù)計(jì)，他們發(fā)現(xiàn)TMS1基因編碼一種熱休克蛋白，這類蛋白基因的敲除，會(huì)使植物的某些發(fā)育過程對(duì)熱脅迫的抵抗力顯著下降.但是，這類高溫敏感雄性不育突變體只在高溫時(shí)才出現(xiàn)顯著的表型，體現(xiàn)了一種植物對(duì)熱脅迫的反應(yīng).

關(guān)于控制植物在常溫下表現(xiàn)為雄性不育的突變體基因已被克隆鑒定的報(bào)道，至今為止只有Millar等［15］發(fā)現(xiàn)的擬南芥myb33和myb65基因.myb33/ myb65雙突變體在常規(guī)擬南芥的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)溫度下出現(xiàn)半不育特征，而在低溫16℃下育性得到大部分的恢復(fù).值得注意的是，myb33和 myb65都編碼GAMYB家族的轉(zhuǎn)錄因子，這暗示了轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在常溫敏雄性不育中，如同外界溫度對(duì)開花的控制一樣，可能也起著舉足輕重的作用.此外，由于myb33/myb65雙突變體的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)過多的液泡，而使絨氈層也同樣出現(xiàn)了體積膨大的表型，因此，atms1和myb33/myb65是否屬于同種調(diào)控途徑的突變體值得進(jìn)一步探討.

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