F型小麥雄性不育系和SQ-1誘導(dǎo)的不育植株花粉形態(tài)電鏡掃描觀察

任文斌 王 倩 吳翠翠 謝三剛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）棉花研究所，044000，山西運(yùn)城）

雜種優(yōu)勢(shì)的利用是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要途徑，在玉米、大豆、水稻、油菜等作物上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[1-4]。我國(guó)雜交小麥研究從 20世紀(jì) 50年代開(kāi)始至今約有70年歷史，取得了許多重要研究成果，但雜交小麥在大面積推廣應(yīng)用方面還面臨巨大困難[5-6]。雜交小麥的研究主要有“三系法”、“兩系法”和“化學(xué)殺雄法”。在以“三系法”為主的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系應(yīng)用方面，T型雄性不育系恢復(fù)源少，K和V型雄性不育系及其測(cè)交后代容易產(chǎn)生單倍體，恢復(fù)源少，恢復(fù)性復(fù)雜，雜種優(yōu)勢(shì)不明顯[7-8]；化學(xué)殺雄法受到化學(xué)殺雄劑生產(chǎn)、花藥敏感性及強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合較少等因素制約[9-10]，難以大面積應(yīng)用。光溫敏兩系法（BNS型和BS型）不育系的穩(wěn)定性受到光照和溫度影響，在年度間變化較大，制種純度難以保障。這些不利因素制約了雜交小麥的發(fā)展[11-12]。我國(guó)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用仍處于初級(jí)階段，還需要繼續(xù)研究探索。

許多學(xué)者從形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞學(xué)、基因組學(xué)等方面對(duì)T、K、V、BNS和BS型等小麥雄性不育系進(jìn)行了大量研究[13]。F型小麥雄性不育系作為運(yùn)城藍(lán)紅雜交小麥研究中心創(chuàng)制的新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，具有旗葉披散、高感白粉病、含有顯性矮稈基因[14]和恢復(fù)源廣等特點(diǎn)，已從農(nóng)藝性狀、細(xì)胞學(xué)、遺傳機(jī)制、雜種優(yōu)勢(shì)利用等方面對(duì)其進(jìn)行了研究。利用化學(xué)殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)小麥雄性不育，其持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、殺雄徹底、無(wú)環(huán)境污染，且殺雄率達(dá)95%以上，已在小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用中被廣泛應(yīng)用[15]。但關(guān)于F型不育系和SQ-1誘導(dǎo)的不育植株花粉粒形態(tài)方面研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)正常發(fā)育、F型不育系以及SQ-1化學(xué)殺雄誘導(dǎo)的不育株的花粉粒進(jìn)行電鏡掃描，觀察花粉粒大小、形態(tài)、萌發(fā)孔形狀等特征，揭示其在發(fā)育過(guò)程中的敗育特性，為兩者在花粉粒不育特征方面提供補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥雄性不育系 FA37-1、FA99-2和FA128-2由運(yùn)城藍(lán)紅雜交小麥研究中心提供。小麥品種舜麥1718和晉麥84由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）棉花研究所提供。SQ-1由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。小麥于2019年10月種植在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所楊包農(nóng)場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉的采集及測(cè)量 在上午8:00-10:00，通過(guò)田間觀察，選取中部有 1～2朵小穗開(kāi)花的麥穗，在小穗中挑選2個(gè)未開(kāi)花的成熟花藥（顏色為淺黃色），解剖獲得正?；ǚ哿?。在舜麥1718和晉麥84旗葉伸長(zhǎng)為倒二葉的1/2時(shí)，按4.0kg/hm2噴灑SQ-1。抽穗后7d左右，在上午8:00-10:00，通過(guò)田間觀察，選取中部1～2個(gè)小穗開(kāi)穎的麥穗，在小穗中選取2個(gè)成熟的花藥，解剖獲得SQ-1誘導(dǎo)花粉粒。用同樣方法獲取F型不育系的花藥。選取不重復(fù)的花粉 20粒，測(cè)量花粉粒的極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)孔長(zhǎng)和寬。

1.2.2 花粉電鏡掃描觀察 將采集到的花粉粒分別放入FAA固定液（100mL體系：38%甲醛5mL，冰醋酸5mL，50%酒精90mL）中固定24h。用蒸餾水清洗3次，每次30min。再分別用50%、70%、80%和90%乙醇進(jìn)行脫水，每次15min。之后用100%乙醇脫水 4次，每次15min。將樣品裝在樣品籠內(nèi)，使用CO2臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥?；ǚ壅吃跇悠放_(tái)上，用EIKO離子濺射儀在其表面進(jìn)行真空噴金鍍膜處理，用Hitachi S530型電鏡進(jìn)行掃描觀察和拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用電鏡增配聯(lián)機(jī)圖像處理分析系統(tǒng)采集圖像。利用Excel和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析[16]，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒大小比較

由表1可知，正常發(fā)育、SQ-1誘導(dǎo)和F型不育系花粉粒大小有較大差異。其中正常發(fā)育花粉粒大小一般為（65.02±5.81）μm×（50.13±4.16）μm，SQ-1誘導(dǎo)的舜麥 1718花粉粒大小約為（46.53±3.95）μm×（40.40±3.18）μm，而F型不育系FA99-2花粉粒大小約（56.93±5.12）μm×（47.44±3.62）μm，表現(xiàn)為正?；ǚ哿＃綟型不育系花粉粒＞SQ-1誘導(dǎo)花粉粒。且三者之間極軸長(zhǎng)差異均達(dá)到極顯著水平。而赤道軸長(zhǎng)方面，SQ-1誘導(dǎo)與其他二者之間達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明花粉粒的大小與育性具有一定的相關(guān)性。

表1 正常發(fā)育、F型不育系及SQ-1誘導(dǎo)的小麥花粉粒比較Table 1 Comparison of pollen grains of F-type male sterile lines, SQ-1 induced and normal development

2.2 花粉粒數(shù)量比較

通過(guò)解剖和粘臺(tái)上觀察，發(fā)現(xiàn)F型雄性不育系的花粉粒較少，從圖1（a）、圖 2（a、d）、圖 3（a、d、g）比較中也可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)型不育系花粉粒遠(yuǎn)少于正常發(fā)育和SQ-1誘導(dǎo)后的花藥，說(shuō)明小麥雄性不育與花粉粒數(shù)量具有一定相關(guān)性。但化學(xué)殺雄并不會(huì)影響花粉粒的數(shù)量，主要影響其形態(tài)特征。

圖1 正?；ǚ哿：兔劝l(fā)孔的形態(tài)特征Fig.1 The morphological characteristics of the normal pollen grains and germinal aperture

圖2 SQ-1誘導(dǎo)的舜麥1718和晉麥84花粉粒和萌發(fā)孔形態(tài)特征Fig.2 The morphological characteristics of the pollen grains and germinal aperture of Shunmai 1718 and Jinmai 84 induced by SQ-1

圖3 雄性不育系FA37-1、FA99-2和FA128-2花粉粒和萌發(fā)孔形態(tài)特征Fig.3 The morphological characteristics of the pollen grains and germinal aperture of FA37-1, FA99-2, and FA128-2 male sterile lines

2.3 花粉粒形態(tài)特征比較

正常發(fā)育的花粉粒盡管有輕微凹陷，但整體上飽滿，形狀規(guī)則，個(gè)別花粉粒較癟（圖1a、b）。SQ-1誘導(dǎo)的舜麥1718與晉麥84花粉粒全部皺扁，呈癟三角形或不規(guī)則畸形，為典型敗育性狀（圖2a、b、d、e）。F型不育系花粉粒瘦癟，基本上呈皺扁三角形或不規(guī)則畸形，也為典型敗育性狀（圖3a、b、d、e、g、h）。說(shuō)明SQ-1誘導(dǎo)和F型不育系花粉粒生長(zhǎng)發(fā)育不完整，容易產(chǎn)生畸形。

2.4 花粉萌發(fā)孔孔蓋形態(tài)比較

正?；ǚ哿Ｃ劝l(fā)孔孔蓋圓潤(rùn)飽滿挺直，緊扣在萌發(fā)孔環(huán)下面，且孔蓋高于萌發(fā)孔環(huán)（圖1c）。SQ-1誘導(dǎo)的舜麥1718花粉粒孔蓋周圍下陷，導(dǎo)致孔蓋低于孔環(huán)，孔蓋與孔環(huán)間距較?。▓D2c）。SQ-1誘導(dǎo)的晉麥 84花粉粒萌發(fā)孔孔蓋呈周圍凹陷、孔蓋凸起，其高度與孔環(huán)平行的畸形形態(tài)（圖2f）。F型不育系FA37-1花粉粒萌發(fā)孔孔蓋凹陷，低于孔環(huán)，中間無(wú)間隙（圖3c）。FA99-2和FA128-2花粉粒萌發(fā)孔孔蓋凹陷，低于孔環(huán)，且孔蓋與孔環(huán)間距較大（圖 3f、i）。

2.5 萌發(fā)孔孔蓋脫落與厚度

由圖4可知，正?；ǚ哿Ｓ忻劝l(fā)孔孔蓋脫落現(xiàn)象，且孔環(huán)邊緣與孔蓋接觸部分在脫落后邊緣清晰可見(jiàn)，無(wú)細(xì)胞牽連?？汕逦鷾y(cè)量出孔環(huán)的厚度約2.22μm（圖4b）。說(shuō)明在花粉粒中萌發(fā)孔孔蓋是一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞組織，與孔環(huán)松散結(jié)合。在花粉粒與柱頭結(jié)合后，是通過(guò)孔蓋脫落還是通過(guò)孔蓋張開(kāi)輸送遺傳和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還需進(jìn)一步觀察。

圖4 正?；ǚ哿Ｃ劝l(fā)孔孔蓋脫落形態(tài)Fig.4 The cap of germinal aperture felling off morphological characteristics of the normal pollen grains

3 討論

F型小麥雄性不育系作為新創(chuàng)制的不育系，對(duì)其研究目前還較淺。有研究[17-18]表明，不育系自交結(jié)實(shí)率在個(gè)別年份能夠降到 5%以下，敗育率達(dá)到95%以上，且易于恢復(fù)。而張思妮等[19]對(duì)花粉粒進(jìn)行碘染，結(jié)果表明其主要以染敗為主，敗育率高達(dá)95.63%。依據(jù)趙卜等[20]對(duì)其小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察，認(rèn)為其由單核期進(jìn)入二核期后，生殖核和營(yíng)養(yǎng)核先后降解，是雄性敗育的主要原因。以上研究與本試驗(yàn)觀察到的結(jié)果類似，F(xiàn)型不育系花藥中的花粉粒數(shù)量較少，減少了與柱頭的接觸，其形態(tài)瘦癟，呈三角形或不規(guī)則畸形，為典型敗育花粉。

SQ-1誘導(dǎo)和F型不育系花粉粒萌發(fā)孔孔蓋周圍都不同程度向下凹陷，呈現(xiàn)不同形狀的畸形孔蓋，且孔蓋高度一般低于孔環(huán)。F型3個(gè)不育系的孔蓋特征基本相似。但SQ-1誘導(dǎo)的舜麥1718和晉麥84孔蓋形態(tài)則完全不同，說(shuō)明不同品種孔蓋形態(tài)有區(qū)別。這與姚雅琴等[21]研究結(jié)果一致，其認(rèn)為萌發(fā)孔孔蓋的突出程度與花粉粒敗育相關(guān)，孔蓋與孔環(huán)接觸程度與不育系恢復(fù)度有關(guān)。通過(guò)花粉粒形態(tài)、孔蓋特征等基本可以判斷花藥的敗育特性。

SQ-1是雜交小麥中廣泛使用的化學(xué)殺雄劑，前人研究[22-24]表明，其對(duì)小麥具有廣譜殺雄效果，不育率一般能夠達(dá)到 95%以上，且不影響小麥雌蕊，這些研究更多側(cè)重于結(jié)實(shí)率、農(nóng)藝性狀、雜種后代表現(xiàn)等。而關(guān)于化學(xué)殺雄后花粉粒的形態(tài)特征研究較少。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化學(xué)殺雄對(duì)花粉粒數(shù)量影響較小，對(duì)花粉粒的形態(tài)特征和萌發(fā)孔孔蓋突出程度影響較大，本研究為SQ-1化學(xué)殺雄后敗育特性提供了有效補(bǔ)充。SQ-1對(duì)噴施時(shí)間要求比較嚴(yán)格，小麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中很難同時(shí)達(dá)到適宜的噴藥階段，配制的雜交種純度難以保證。因此，盡管兩者都可以作為小麥雜種優(yōu)勢(shì)選擇的母本，但實(shí)踐應(yīng)用中仍有需解決的問(wèn)題，距產(chǎn)業(yè)化發(fā)展還有較大差距。

4 結(jié)論

F型小麥雄性不育系作為新的不育系，已從細(xì)胞學(xué)方面對(duì)其不育特征進(jìn)行了一些初步研究，觀察到其花粉粒具有典型的敗育特征，萌發(fā)孔凹陷，花粉粒呈三角形等不規(guī)則形狀等，其不育性的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高。利用化學(xué)殺雄劑SQ-1誘導(dǎo)的花粉粒也具有典型的敗育特征。