基于小波的腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析模型

黃文佳， 馮鐵男， 王翼飛

(上海大學(xué)理學(xué)院，上海200444)

基因芯片(gene chips)是目前最主要的且發(fā)展最早、最快的生物芯片［1］.將待測(cè)樣本標(biāo)記后與基因芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)激光共聚焦熒光掃描儀掃描，通過(guò)電腦系統(tǒng)處理、分析即可得到相應(yīng)的信號(hào)值.信號(hào)值代表了結(jié)合在探針上的待測(cè)樣本中特定大分子的信息，從而可檢測(cè)對(duì)應(yīng)片段是否存在及存在量的多少.狹義的基因芯片又叫DNA微陣列(DNA microarray)，主要包括cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列.

DNA芯片技術(shù)作為一種高通量的基因表達(dá)分析平臺(tái)，通過(guò)一次試驗(yàn)就能獲得成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、疾病診斷和藥物篩選等多個(gè)領(lǐng)域［2］.由于基因表達(dá)的信號(hào)值常常受到噪音的污染，而傳統(tǒng)的研究方法無(wú)法將其去除，因此經(jīng)常在發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)基因時(shí)出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性，降低了樣本聚類(lèi)的準(zhǔn)確率，并且對(duì)研究基因表達(dá)模式、提取分類(lèi)特征基因等帶來(lái)了一定的困難.

小波變換(wavelet transformation)是空間(時(shí)間)和頻率的局部變換，因而能有效地從信號(hào)中提取信息，通過(guò)伸縮和平移等運(yùn)算功能，可對(duì)函數(shù)或信號(hào)進(jìn)行多尺度的細(xì)化分析，特別適用于非穩(wěn)定信號(hào)的信息提取［3］.

為解決聚類(lèi)過(guò)程中存在的一些問(wèn)題，本研究通過(guò)對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行小波變換，降低表達(dá)值中的噪音，從而為提取出基本信息建立了一種新的聚類(lèi)分析模型.通過(guò)該模型選取的特異表達(dá)基因，對(duì)于腫瘤樣本的分類(lèi)、腫瘤疾病的診斷和治療都具有重要意義.

1 聚類(lèi)分析模型

1.1 傳統(tǒng)的腫瘤聚類(lèi)分析模型

腫瘤聚類(lèi)分析模型［4］假設(shè)具有相同或相似表達(dá)模式的基因功能相同或相近，因此通過(guò)聚類(lèi)分析可以將基因分為不同的類(lèi)型，同時(shí)選取出少量的特異表達(dá)基因?qū)颖具M(jìn)行聚類(lèi).

腫瘤聚類(lèi)分析模型的主要流程如下：①獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理和歸一化;② 依次計(jì)算每個(gè)基因的綜合屬性，將每個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)值轉(zhuǎn)化為一個(gè)數(shù)值;③選取少量的特異表達(dá)基因，選擇一種聚類(lèi)分析方法對(duì)基因和樣本分別進(jìn)行聚類(lèi)，將表達(dá)模式相似的基因聚為一類(lèi)，這些基因可能具有相同或相似的功能.通過(guò)對(duì)樣本聚類(lèi)，可以將正常樣本聚為一類(lèi)或?qū)⒓膊颖揪蹫橐活?lèi)，也可將疾病樣本分為不同的疾病亞型，這將為進(jìn)一步深入研究腫瘤疾病提供重要的信息.

1.2 改進(jìn)的聚類(lèi)分析模型

傳統(tǒng)的腫瘤聚類(lèi)分析模型由于芯片的背景噪音等常會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，導(dǎo)致較高的錯(cuò)聚率.本研究建立了一種改進(jìn)的聚類(lèi)分析模型(見(jiàn)圖1)，其創(chuàng)新點(diǎn)在于運(yùn)用小波變換的方法來(lái)降低噪音.通過(guò)小波變換，可以有效去除假陽(yáng)性的差異表達(dá)基因，從而降低樣本的錯(cuò)聚率.這里的錯(cuò)聚率是指聚到錯(cuò)誤類(lèi)別的樣本個(gè)數(shù)占樣本總數(shù)的比率.

1.2.1 基因排序

對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的每一行(即一個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)值)進(jìn)行逐個(gè)記分，得分越高則基因的差異表達(dá)程度越高.將基因按照記分高低排序，挑選得分高的基因作為特異表達(dá)基因.

圖1 腫瘤基因表達(dá)數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析模型Fig.1 Cluster analysis model of tumor gene expression data

1.2.2 耦合雙向聚類(lèi)

耦合雙向聚 類(lèi)(coupled two-way clustering，CTWC)是Getz等［7］提出的一種無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)框架.該聚類(lèi)方法是一個(gè)迭代的過(guò)程，通過(guò)采用啟發(fā)式的方法尋找由穩(wěn)定的樣本簇和基因簇構(gòu)成的子矩陣，從而得到穩(wěn)定的聚類(lèi)結(jié)果.該方法動(dòng)態(tài)地利用了樣本簇和基因簇之間的關(guān)系，交替地使用基因簇作為特征聚類(lèi)樣本或者使用樣本簇作為特征聚類(lèi)基因，最終得到生物學(xué)上相關(guān)的基因聚類(lèi)簇和樣本聚類(lèi)簇［8］.

本研究選定的錯(cuò)聚率閾值為15%.若樣本聚類(lèi)的錯(cuò)聚率低于閾值，說(shuō)明該數(shù)據(jù)集存在的噪音不大，無(wú)需進(jìn)行小波變換來(lái)降低噪音;若高于閾值，說(shuō)明該數(shù)據(jù)集存在較大的噪音，需要通過(guò)小波變換來(lái)降低噪音.

1.2.3 小波變換

若基因表達(dá)數(shù)據(jù)存在較大的噪音，則需采用一種科學(xué)的數(shù)據(jù)處理方法來(lái)降低噪音.小波變換作為近年來(lái)信號(hào)去噪的一個(gè)有力工具，能以非常小的失真度實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的壓縮與消噪［9］，其表達(dá)式為C(scale，time_position)=∫f(τ)Ψ(scale，τ)dτ.通過(guò)小波變換，信號(hào)可以被分解為高頻部分和低頻部分.對(duì)于被噪音污染的信號(hào)，小波將其分解為代表近似信號(hào)特征的低頻部分和代表噪音及擾動(dòng)的高頻部分［4，10］.

本研究采用雙正交小波3.3(biorthogonal wavelet 3.3)進(jìn)行3個(gè)層次的離散小波變換(見(jiàn)圖2).通常經(jīng)小波變換后，信號(hào)的噪音可被有效地降低.小波將該信號(hào)值進(jìn)行了3層分解，即

其中A1層保留了信號(hào)的基本特征，A2和A3層只保留了少量的低頻信號(hào)，D1，D2和D3層包含了原始信號(hào)在不同層次下的噪音及擾動(dòng)信號(hào).本研究選用A1層近似表示基因的原始信號(hào)值并對(duì)其進(jìn)行分析.

圖2 對(duì)原始信號(hào)進(jìn)行3個(gè)層次的離散小波變換Fig.2 Using discrete wavelet to transform the original signal at level 3

1.2.4 剔除相關(guān)性強(qiáng)的基因

由于通過(guò)RFSC篩選出的特異表達(dá)基因中可能存在功能相同或相似的基因，即存在一定的冗余基因;而從生物學(xué)的角度分析，基因之間存在調(diào)控和相互作用，這在表達(dá)譜中反映為不同基因在表達(dá)水平上存在一定程度的相關(guān)性［4］，據(jù)此可以進(jìn)行冗余基因的排除.

算法的主要步驟如下：①計(jì)算特異表達(dá)基因兩兩之間的相關(guān)系數(shù)，若有n個(gè)特異表達(dá)基因，則計(jì)算n(n+1)/2次;②對(duì)計(jì)算出的基因兩兩之間的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行排序，挑選出相關(guān)系數(shù)最高的2個(gè)基因，剔除得分較低的基因;③ 再次進(jìn)行聚類(lèi)，當(dāng)樣本錯(cuò)聚率高于閾值時(shí)，返回到步驟②，當(dāng)樣本錯(cuò)聚率低于閾值時(shí)，停止;④找出樣本錯(cuò)聚率達(dá)到最低時(shí)的最少基因數(shù)目，將這些基因作為特異表達(dá)基因.

第i和第j個(gè)基因的相關(guān)系數(shù)的計(jì)算公式為

當(dāng)i=j時(shí)，基因的自相關(guān)系數(shù)rij=1;當(dāng)i≠j時(shí)，rij的取值在0～1之間.

2 應(yīng)用算例

2.1 材料

本研究以腫瘤基因表達(dá)譜為研究對(duì)象，選取Alon等［11］公布的結(jié)腸癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集作為分析數(shù)據(jù).該數(shù)據(jù)包含62個(gè)樣本(數(shù)據(jù)的下載地址為http：//microarray.princeton.edu/oncology/affydata/ index.html)，每個(gè)樣本均含2 000個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中40個(gè)樣本被診斷為結(jié)腸癌(Tumor)，其余22個(gè)樣本為正常樣本(Normal).

2.2 分析過(guò)程與結(jié)果

本研究以上述結(jié)腸癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集為例來(lái)進(jìn)行實(shí)際分析.通過(guò)RFSC對(duì)結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集的每個(gè)基因進(jìn)行打分，從2 000個(gè)基因中挑選出39個(gè)得分最高的特異表達(dá)基因.

2.2.1 選取特征基因

對(duì)39個(gè)結(jié)腸癌特異表達(dá)基因及62個(gè)樣本進(jìn)行耦合雙向聚類(lèi)，得到的樣本聚類(lèi)圖如圖3所示，其中圖3(a)由未經(jīng)小波處理挑選出的特異表達(dá)基因聚類(lèi)得到，樣本錯(cuò)聚率達(dá)到33.87%，圖3(b)由經(jīng)過(guò)小波處理后挑選出的特異表達(dá)基因聚類(lèi)得到，樣本錯(cuò)聚率為11.29%.由圖可見(jiàn)，通過(guò)小波處理有效地降低了原始信號(hào)的噪音以及樣本的錯(cuò)聚率，對(duì)比之前未經(jīng)小波變換處理的原始信號(hào)，處理后的信號(hào)通過(guò)耦合雙向聚類(lèi)得到了更好的效果.

圖3 耦合雙向聚類(lèi)得到的結(jié)腸癌樣本聚類(lèi)圖Fig.3 Cluster tree of colon samples through CTWC

2.2.2 剔除假陽(yáng)性基因

經(jīng)過(guò)小波變換后，部分假陽(yáng)性基因被有效剔除.探針號(hào)為R99907的基因在未經(jīng)小波變換處理之前被判定為特異表達(dá)基因，但通過(guò)小波變換對(duì)該基因的信號(hào)值進(jìn)行2層分解(見(jiàn)圖4)后，該基因被認(rèn)定為冗余基因而被剔除.從圖4可以看出，有一個(gè)正常樣本的表達(dá)值達(dá)到了2 029.322，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他19個(gè)正常樣本的平均表達(dá)值70.186.假設(shè)該樣本與其他樣本存在顯著差異，通過(guò) t-檢驗(yàn)得出該樣本(Normal-11)的p-value為5.588 6E-020(當(dāng)p-value＜0.05，拒絕假設(shè))，因此該樣本與其他正常樣本不存在顯著差異，是一個(gè)被噪音污染的基因.另外，通過(guò)查詢(xún)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)可知，該基因?yàn)楦蓴_素調(diào)節(jié)因子-2，是轉(zhuǎn)錄因子基因家族中的一員，其基因符號(hào)為IRF2.IRF2競(jìng)爭(zhēng)性抑制IRF1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活的干擾素α和β，還具有組蛋白H4的轉(zhuǎn)錄激活因子的作用，但通過(guò)查詢(xún)結(jié)腸癌的基因調(diào)控通路，目前暫時(shí)還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該基因與結(jié)腸癌的發(fā)生有直接的聯(lián)系.

圖4 探針號(hào)為R99907的基因原始信號(hào)的小波多尺度分解圖Fig.4 Wavelet multiresolution decomposition of original signal of gene R99907

2.2.3 聚類(lèi)結(jié)果分析

本研究通過(guò)建立一種聚類(lèi)分析模型來(lái)分析結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集.采用小波變換對(duì)表達(dá)信號(hào)值降噪，剔除了結(jié)腸癌特異表達(dá)基因中相關(guān)性強(qiáng)的基因，并從篩選出的39個(gè)特異表達(dá)基因中剔除了12個(gè)冗余基因，從中挑選出27個(gè)特異表達(dá)基因(見(jiàn)表1).通過(guò)對(duì)這27個(gè)特異表達(dá)基因及62個(gè)樣本進(jìn)行耦合雙向聚類(lèi)，樣本的錯(cuò)聚率為8.06%.聚類(lèi)效果如圖5所示，圖中的第1～25行被聚為Normal類(lèi)，第26～62行被聚為T(mén)umor類(lèi).特異表達(dá)基因被聚為4類(lèi)：第1～17列的基因被聚為1，2類(lèi)，這2類(lèi)基因在腫瘤樣本中相對(duì)下調(diào)表達(dá);第18～27列被聚為3，4類(lèi)，這2類(lèi)基因在腫瘤樣本中相對(duì)上調(diào)表達(dá).Alon等［11］提出可以依靠數(shù)量更少的基因?qū)颖具M(jìn)行聚類(lèi)，并選出了500個(gè)基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到了較低的錯(cuò)聚率.通過(guò)對(duì)比幾種不同的聚類(lèi)模型(見(jiàn)表2)可知，改進(jìn)的聚類(lèi)分析模型不但降低了樣本的錯(cuò)聚率，也減少了對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)的基因數(shù)量，改進(jìn)后的腫瘤聚類(lèi)分析模型取得了較好的效果.

2.2.4 關(guān)于腫瘤基因表達(dá)譜的分析結(jié)果

(1)樣本聚類(lèi)結(jié)果.

62個(gè)樣本聚類(lèi)結(jié)果表明，所有樣本分類(lèi)基本準(zhǔn)確，其中正類(lèi)樣本(Normal)的錯(cuò)聚率為4.54%，負(fù)類(lèi)樣本(Tumor)的錯(cuò)聚率為10.00%，總的樣本錯(cuò)聚率為8.54%.

(2)特異表達(dá)基因.

根據(jù)分析結(jié)果可知，27個(gè)基因在結(jié)腸癌中差異表達(dá)，其中17個(gè)基因在結(jié)腸癌樣本中相對(duì)下調(diào)表達(dá);10個(gè)基因相對(duì)上調(diào)表達(dá).在結(jié)腸癌中下調(diào)表達(dá)的基因主要有：細(xì)胞功能調(diào)控相關(guān)基因CRSP1;蛋白質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因CDH3，CKS1B;蛋白質(zhì)編碼相關(guān)基因DES，MYL9，CLNS1A;核糖蛋白合成相關(guān)基因SND1;細(xì)胞通訊相關(guān)基因 ITGA6，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因FBL.下調(diào)表達(dá)的基因主要有：核酸和蛋白質(zhì)綁定功能、轉(zhuǎn)錄因子激活功能的基因PABPC1;離子膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能基因PLP2;編碼免疫蛋白的相關(guān)基因HSPD1;調(diào)節(jié)酶活性的相關(guān)基因ACHY.

本研究通過(guò)改進(jìn)的聚類(lèi)分析模型所發(fā)現(xiàn)的27個(gè)特異表達(dá)基因在結(jié)腸癌中保持差異表達(dá)，因此，可以推斷這些基因在正常組織癌變的過(guò)程中所起到的重要作用，與結(jié)腸癌的發(fā)生可能存在著密切的聯(lián)系.

表1 結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集的特異表達(dá)基因Table 1 Specific expressed genes of colon tumor dataset

圖5 27個(gè)基因的耦合雙向聚類(lèi)效果圖Fig.5 Cluster of 27 genes through CTWC

表2 幾種不同聚類(lèi)分析模型的結(jié)果對(duì)比Table 2 Results contrast of different cluster analysis models %

3 結(jié)束語(yǔ)

近年來(lái)，研究基因表達(dá)數(shù)據(jù)的方法層出不窮，但對(duì)于如何從大量基因中剔除冗余基因、去除表達(dá)信號(hào)中的噪音仍然是研究的難題.本研究針對(duì)腫瘤基因數(shù)據(jù)的聚類(lèi)問(wèn)題所建立的模型只需提取少量的基因就能用于腫瘤樣本的聚類(lèi).但是在進(jìn)行小波變換去噪的過(guò)程中也可能將某些有意義的基因剔除，如果能夠構(gòu)造一種專(zhuān)門(mén)用于給基因表達(dá)數(shù)據(jù)去噪的小波，將有助于該模型成為基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析的有力工具.

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