水黃皮根總黃酮提取工藝的研究

趙映淑， 朱 毅*， 董 志， 陳國(guó)彪

(1.海南省藥品檢驗(yàn)所，海南省藥物質(zhì)量研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70216;2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016)

水黃皮Pongamia pinnata(L.)Merr.為豆科(Leguminosae)水黃皮屬(Pongamia Vent.)的半紅樹植物，別名水流豆［1］。水黃皮在民間具有廣泛的應(yīng)用，用于治療疥癬、皰疹、支氣管炎、百日咳、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、消渴病、白斑病、麻風(fēng)病和腰痛等疾病［2］。近年來，研究結(jié)果證明水黃皮具有巨大的藥用潛力，在抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗消化性潰瘍、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降糖以及鎮(zhèn)靜等方面具有明顯的作用，且主要活性成分為黃酮類化合物，其中呋喃黃酮為指標(biāo)性成分［3-14］。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法篩選醇提取水黃皮根中總黃酮的最佳工藝條件，為深入研究水黃皮的藥理作用和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BS210S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司);R-502旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司);UV-2010型紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU)

1.2 試藥 水黃皮素(和光純藥株式會(huì)社，批號(hào):WKR239，純度:95%);乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純;水黃皮根于2008年6月采集于海南省?？谑校珊Ｄ鲜∷幤窓z驗(yàn)所中藥室鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷真空干燥24 h的水黃皮素對(duì)照品5.42 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得每1 mL含水黃皮素51.49 μg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 將正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)下水黃皮根總黃酮提取液回收適量乙醇后定容至100 mL，再精密吸取1～2 mL用甲醇定容至50mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取水黃皮對(duì)照品溶液，以甲醇為空白，于200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)記錄吸收光譜，由光譜圖表明，水黃皮素在波長(zhǎng)260 nm和304 nm處有最大吸收。另取供試品溶液，在相同條件下經(jīng)紫外掃描，發(fā)現(xiàn)在260 nm處有最大吸收峰，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇為空白，于260 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，水黃皮素濃度為橫坐標(biāo)作圖回歸，得回歸方程為:Y=94.415 81X+0.008 17，r=0.999 6。結(jié)果表明，濃度在5.149～36.040 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 提取工藝篩選

2.2.1 單因素試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們考察了乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%和 90%，n=3)、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃，n=3)、提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h，n=3)、提取次數(shù)(1 次、2 次、3 次，n=3)以及固液比(10倍、15倍、20倍和25倍，n=3)對(duì)水黃皮根總黃酮提取效果的影響。每次固定準(zhǔn)確稱取5 g水黃皮根樣品進(jìn)行試驗(yàn)，所得提取液濾過后定容，測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液中總黃酮濃度，再計(jì)算提取液中總黃酮的量(總黃酮量=提取溶液中的總黃酮質(zhì)量/提取時(shí)藥材質(zhì)量×100%)。結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明:乙醇濃度、固液比以及提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響較大;提取溫度在80℃～90℃時(shí)相差不大，同時(shí)提取次數(shù)越多提取越完全。綜合考慮各因素，本試驗(yàn)固定提取溫度為80℃，提取次數(shù)為3次。選擇乙醇濃度、提取時(shí)間和固液比作為正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察的指標(biāo)。

2.2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度(%)、提取時(shí)間(h)、和固液比(m/v)為影響因素，以總黃酮量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)篩選最佳提取工藝。因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

由正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析和方差分析(表3)可知，影響水黃皮根總黃酮提取效果的因素順序?yàn)?A＞B＞C，A、B兩因素的影響具有顯著性，C不具顯著性。得最佳工藝組合為A2B2C3，即每1 g藥材用20倍量60%乙醇提取3次，每次1.0 h。

表2 L9(34)正交設(shè)計(jì)

表3 方差分析結(jié)果

2.3 最佳提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取3份干燥的水黃皮根粉5 g，按最佳工藝條件平行操作測(cè)吸光度，根據(jù)回歸方程得出水黃皮根中總黃酮量，結(jié)果見表4。

表4 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明:采用最佳工藝條件提取時(shí)，水黃皮根總黃酮提取率均高于其他正交試驗(yàn)提取率，說明本試驗(yàn)篩選的最佳提取工藝條件比較合理，同時(shí)具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 水黃皮根中含有的黃酮類化合物主要是水黃皮素、水黃皮黃素等呋喃黃酮類［15］，易溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷等有機(jī)溶劑，不溶于水。為了建立適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法，本試驗(yàn)選擇乙醇溶液作為水黃皮根總黃酮的提取溶劑，采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選了最佳提取工藝條件。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，60%乙醇溶液可作為水黃皮根總黃酮的最佳提取溶劑。

3.2 本實(shí)驗(yàn)對(duì)水黃皮根總黃酮的提取方法進(jìn)行了初步探討，旨在為近一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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