RP-HPLC法測定皺葉鳳毛菊中3種有效成分

王 歡， 吉守祥， 賈麗紅， 盧永昌

（青海民族大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院青海西寧 810007）

皺葉鳳毛菊Saussurea malitiosaMaxim.為菊科植物，生于灌叢中、砂質(zhì)山坡，海拔3 000～4 300 m［1］，為藏醫(yī)常用草藥。皺葉鳳毛菊味苦，性涼，無毒，具有止血清熱等功效［2］，治療瘡傷流血，解肉食中毒，清脈熱、血熱。全草入藥治中毒性熱癥及骨折、風(fēng)濕性筋骨痛［3］。蘆丁能維持毛細(xì)血管抵抗力、降低其通透性及脆性，還有抗炎、利尿、抗過敏、降血脂等作用，是醫(yī)藥工業(yè)中制備羥乙蘆丁、蘆丁片、曲克蘆丁等藥的主要原料［4］;木犀草素具有清熱、解毒、消炎的作用，是用于治療炎癥疾病的有效成分［5-6］，國內(nèi)外主要集中在對人體黑素瘤細(xì)胞的保護(hù)作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制肝細(xì)胞生長因子等方面［7-9］進(jìn)行開發(fā)研究。異鼠李素具有抗癌、抗心肌缺血缺氧、抗心律失常、降膽固醇、止咳祛痰、消食化滯、活血散瘀、抑制心肌細(xì)胞凋亡［10-12］等作用，主要治療咳嗽痰多、消化不良、食積腹痛、瘀血經(jīng)閉等疾病。本試驗(yàn)利用HPLC測定了皺葉鳳毛菊中3種有效成分，旨在為合理利用和開發(fā)這一植物的藥理活性提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司）、Eclipse XOB-C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）色譜柱、KQ3200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、電子天平（賽多利斯ME215S）。

蘆?。?0080-200306）、木犀草素（111520-200201）、異鼠李素（110860-200406）均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠）;水（娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈百立食品有限公司）;磷酸為AR級（北京紅星化工廠）。

皺葉鳳毛菊于2008年8月采于青海省互助北山林場，由中國科學(xué)院西北高原生物研究所孫洪發(fā)研究員鑒定，樣品陰干后，冷藏保存。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XOB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動相∶甲醇和水（含0.04%磷酸）以0～12 min，44% ～44%甲醇，體積流量為1 mL/min;20～25 min，56% ～66%甲醇，體積流量0.5 mL/min的梯度洗脫;檢測波長為360 nm;柱溫:30℃。該色譜條件下蘆丁、木犀草素、異鼠李素3種成分均被洗脫且達(dá)到基線分離，見圖1。

1.2.2 對照品溶液的配置 分別精密稱取適量的蘆丁、木犀草素、異鼠李素對照品，用甲醇溶解，于5 mL的量瓶中定容，搖勻作對照品溶液備用。

1.2.3 供試品溶液 精密稱取皺葉鳳毛菊樣品2.0 g，加入甲醇10 mL，超聲提取35 min，過濾，用濾渣重復(fù)上述操作2次，將3次提取的濾液合并，定容于50 mL量瓶中。過0.45 μm濾膜，將濾液作為供試品溶液備用。

1.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取適量3種對照品貯備液混合，得混合對照品標(biāo)液。并吸取10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測定，各組分進(jìn)樣量（μg）與峰面積A進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

圖1 3種對照品（A）和皺葉鳳毛菊提取物（B）色譜圖

1.2.5 檢測限 在以上色譜條件下，當(dāng)信噪比S/N=3時，測定各組分，測得蘆丁、木犀草素、異鼠李素的最低檢測限分別為0.23、0.36和0.32 ng。

1.2.6 精密度試驗(yàn) 取上述混合對照品溶液10 μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰的峰面積，得3種活性成分的峰面積RSD分別為0.92%，0.86%和1.1%（n=5），表明儀器精密度良好。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取上述的供試品溶液，在選定的色譜條件下，連續(xù)3 d進(jìn)樣，記錄蘆丁、木犀草素、異鼠李素的峰面積，得峰面積RSD分別為1.5%，1.1%和1.8%（n=3），表明供試品溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取測試樣品粉末5份，按1.2.3項(xiàng)下的方法，制備成供試品溶液。按1.2.1項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣并記錄峰面積，計(jì)算各組分的量，得蘆丁、木犀草素、異鼠李素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為0.98%、0.95%和1.56%（n=5）。

1.2.9 回收率試驗(yàn) 稱取已知量的皺葉鳳毛菊5份各約2.0 g，分別加入一定量的混合對照品溶液，制備成供試品溶液（同1.2.3項(xiàng)），按上述的色譜條件進(jìn)行測定，蘆丁、木犀草素、異鼠李素的平均回收率，見表2。

1.2.10 樣品測定 精密稱取測試樣品約2.0 g，制備樣品溶液（同1.2.3項(xiàng)），在選定的色譜條件下進(jìn)樣，經(jīng)DAD檢測器檢測上述3種待測組分的峰純度且其紫外光譜與對照品一致后，按外標(biāo)法以峰面積積分值計(jì)算，結(jié)果見表3。

2 討論

2.1 檢測波長的確定 將蘆丁、木犀草素和異鼠李素對照品溶液經(jīng)DAD檢測器在紫外區(qū)域進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在254 nm、274 nm、320 nm及360 nm均有吸收。而在360 nm處其他組分吸收較少，3種成分紫外吸收良好，有利于測定，故選擇360 nm作為其檢測波長。

2.2 提取方法確定 通過試驗(yàn)，分別測試了甲醇、乙醇回流提取和甲醇、乙醇超聲提取等條件下的提取率，結(jié)果證明用甲醇超聲提取時提取率較高。

2.3 流動相的選擇 在篩選黃酮苷類活性成分測定的色譜條件過程中，由于3種成分很難達(dá)到基線分離，曾嘗試過用不同比例的甲醇和水及乙腈和水作為的流動相，由于乙腈成本較高，故選用甲醇和水作為流動相，最終發(fā)現(xiàn)甲醇-水（0.04%磷酸）為0～12 min，44% ～44%甲醇，體積流量為1 mL/min;20～25 min，56% ～66%甲醇，體積流量0.5 mL/min的梯度時，3種活性成分均被洗脫且達(dá)到基線分離。在色譜圖中出現(xiàn)了前面峰寬，后面峰窄的現(xiàn)象，可能是由于流動相中溶劑的比例不同而導(dǎo)致。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=5）

表3 皺葉鳳毛菊3種主要成分測定結(jié)果 （n=5）

2.4 從測定結(jié)果看 皺葉鳳毛菊中3種黃酮成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可作為皺葉鳳毛菊藥材質(zhì)量控制檢測的成分。

［1］中國科學(xué)院西北高原生物研究所.青海植物志（第3卷）［M］.西寧:青海人民出版社，1996.

［2］中國科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志［M］.西寧:青海人民出版社，1996:198.

［3］中國科學(xué)院西北高原生物研究所.青海經(jīng)濟(jì)植物志［M］.西寧:青海人民出版社，1987:646.

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