HPLC-ESI-MSn法測(cè)定黃芪藥材中黃芪甲苷

李 晶， 韋露莎， 申旭霽， 趙新鋒， 王世祥， 鄭曉暉，2*

（1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069;2.西北大學(xué)與深圳清華大學(xué)研究院共建“創(chuàng)新中藥及天然藥物研究”聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518057）

黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，是中醫(yī)臨床廣泛用于補(bǔ)氣固表和托毒排膿的藥材之一［1］。黃芪含皂苷、黃酮、多糖及氨基酸等多種化學(xué)成分，黃芪皂苷為黃芪的主要活性成分，并以黃芪甲苷為主［2］。目前，有關(guān)黃芪甲苷的測(cè)定方法包括高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，高效液相色譜-紫外檢測(cè)法，薄層掃描法［3-5］。上述方法對(duì)黃芪藥材及其制劑中黃芪甲苷的測(cè)定有重要意義，且有潛在的推廣應(yīng)用前景。然而，由于黃芪甲苷為紫外末端吸收物質(zhì)，其在復(fù)雜體系中高效測(cè)定方法的建立仍然是需進(jìn)一步研究的問(wèn)題之一。本試驗(yàn)建立了黃芪醇提物中黃芪甲苷的高效液相色譜-電噴霧-離子阱（HPLC-ESI-MSn）測(cè)定方法，旨在為復(fù)雜體系中黃芪甲苷的快速測(cè)定提供方法。

1 儀器與試藥

儀器:Agilent1100系列高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括二元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器、電噴霧離子源、SL型離子阱質(zhì)譜和Chemistation 5.2工作站。

材料及試劑:黃芪（購(gòu)于西安藻露堂藥店，經(jīng)西安市藥品檢驗(yàn)所鑒定）;黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110781-200613）;色譜純甲醇（美國(guó)Fisher公司）;實(shí)驗(yàn)用水為超純蒸餾水（自制）;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

色譜條件:色譜柱為 Agilent SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-0.2% 甲酸水（70 ∶30，v∶v）;體積流量為0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;柱后2:1分流，三分之一流出液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜條件:電噴霧正離子模式檢測(cè);霧化氣壓力為35.0 psi;干燥氣溫度為350℃，流速為8.0 L/min;黃芪甲苷選擇離子對(duì)為m/z807.4→627.2;質(zhì)量掃描范圍為100～1 000 amu。該條件下，黃芪藥材中黃芪甲苷提取離子流圖和質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖1和圖2。

2.2 供試品溶液的制備 黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品5.2 mg，甲醇溶解于5.0 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，制備成濃度為1.04 mg/mL的對(duì)照品溶液。

圖1 黃芪甲苷提取離子流圖

黃芪藥材供試品溶液的制備:取黃芪藥材20.0 g，50.0℃干燥至恒重。粉碎，過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取藥材粉末5.0 g，置具塞錐形瓶中，加10倍量甲醇，冷浸過(guò)夜，超聲提取3次，每次30 min，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙庵?0.0 mL量瓶中，加甲醇至刻度，4.0℃冷藏備用［6］。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL，用甲醇稀釋并定容到 1.0 mL 量瓶中，制備系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液。在擬定分析條件下，準(zhǔn)確吸取10.0 μL進(jìn)樣分析。黃芪甲苷離子選擇m/z807.4為母離子，627.2為子離子，測(cè)定提取離子流圖峰面積［7-8］。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以提取離子流圖峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為:Y=379.18X+9.052 1（r=0.999 7），提示黃芪甲苷在0.10～1.04 mg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。以3倍信噪比為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得黃芪甲苷的最低檢測(cè)限為5 ng/mL（S/N=3）。

圖2 黃芪甲苷質(zhì)譜圖

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 在擬定分析條件下，精密吸取黃芪藥材供試品溶液10.0 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄提取離子流圖峰面積，測(cè)定黃芪甲苷量，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.7%，提示該方法具有較好的精密度。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一黃芪樣品5份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在擬定分析條件下，準(zhǔn)確吸取10.0 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷量，計(jì)算得RSD為3.2%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取黃芪藥材供試品溶液，分別在0、4、8、16、24 h和36 h后，在擬定分析條件下，準(zhǔn)確吸取10.0 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷量，計(jì)算得RSD為2.4%，提示黃芪供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取5份黃芪甲苷量已知的黃芪藥材，每份5.0 g，分別準(zhǔn)確加入濃度為1.04 mg/mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液2.0 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在擬定分析條件下，準(zhǔn)確吸取10.0 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，方法平均回收率為96.51%，表明該方法具有較好的回收率。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=5）

2.8 樣品測(cè)定 分別精密稱(chēng)取黃芪藥材3份，每份5.0 g，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在擬定分析條件下，準(zhǔn)確吸取10.0 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，供試藥材中黃芪甲苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.54 mg/g。

3 討論

3.1 黃芪甲苷為末端紫外吸收物質(zhì)［9］，采用紫外檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定，一般具有靈敏度差等不足。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器雖然能用于黃芪甲苷等紫外末端吸收物質(zhì)的測(cè)定，但線(xiàn)性范圍一般低于3個(gè)數(shù)量級(jí)，且在靈敏度方面與紫外相比并未顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。質(zhì)譜法以氣態(tài)離子為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)靈敏度不受待測(cè)對(duì)象紫外光吸收性質(zhì)的限制，在紫外末端吸收物質(zhì)的測(cè)定方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，本試驗(yàn)以質(zhì)譜法為手段，進(jìn)行黃芪藥材中黃芪甲苷的測(cè)定。

3.2 本試驗(yàn)采用多級(jí)反應(yīng)模式即選擇離子對(duì)法進(jìn)行黃芪甲苷的測(cè)定。該方法以黃芪甲苷的準(zhǔn)分子離子m/z807.4和二級(jí)碎片離子m/z627.2為離子對(duì)對(duì)藥材中的黃芪甲苷進(jìn)行定性，具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。此外，由于選擇離子對(duì)法能有效排除復(fù)雜體系中的基質(zhì)對(duì)待測(cè)對(duì)象的干擾，因此不僅能有效縮短分析時(shí)間，而且靈敏度高。綜上，本試驗(yàn)所建立的黃芪藥材中黃芪甲苷的測(cè)定方法，具有靈敏度高，重現(xiàn)性好和快速的特點(diǎn)，可用于黃芪藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)，而且有望為生物樣品等復(fù)雜體系中黃芪甲苷的快速測(cè)定提供方法。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2010:283-284.

［2］江 燕，晁若冰.黃芪藥材中黃芪甲苷和總皂苷含量的比較［J］.華西藥學(xué)雜志，2007，22（3）:322-324.

［3］蔣紅艷，楊元娟，何 靜，等.黃芪及其制劑中黃芪甲苷定量分析方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2009，7（10）:209-211.

［4］周春玲，魯 靜.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2000，25（3）:166-168.

［5］莫 迎，陸石英，葉 萍，等.HPLC-ELSD測(cè)定芪丹益肝膠囊中黃芪甲苷含量［J］.中成藥，2009，31（10）:附4-附6.

［6］南換杰，李曉娜，秦雪梅，等.黃芪及其制劑中測(cè)定黃芪甲苷含量時(shí)供試液制備方法的改進(jìn)［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（19）:1627-2630.

［7］Huang Chenrong，Wang Guangji，Li Hao，et al.Sensitive and selective liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry analysis of astragaloside IV in rat plasma［J］.Pharm Biomed Anal，2006，（40）:788-793.

［8］賈曉斌，陳 彥，蔡寶昌，等.HPLC-MS（TOF）法測(cè)定家兔血漿中黃芪甲苷的濃度［J］.中成藥，2005，27（3）:323-325.

［9］毛文彬，相 莉，馮 偉.HPLC-ELSD測(cè)定黃芪藥材及其炮制品中黃芪甲苷的含量［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（15）:1853-1854.