高效液相色譜法優(yōu)選四味中藥的提取方法

容 蓉， 邱麗麗， 呂青濤， 蔣海強(qiáng)， 王 薇， 李 峰

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355;2.勝利油田中心醫(yī)院，山東東營 257000）

中藥寒、熱、溫、涼的藥性是其所含成分作用于機(jī)體的客觀反映，是區(qū)別于植物藥和天然藥的重要標(biāo)志［1］。自上世紀(jì)70年代以來，很多學(xué)者對中藥四性的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了探索研究，但哪些成分起寒涼作用、哪些起溫?zé)嶙饔?，藥性是中藥單一成分的作用、還是多種成分的綜合表現(xiàn)，尚須深入研究［2］。在總結(jié)近40年研究工作的基礎(chǔ)上，歐陽兵等提出“組群中藥四性組合性效譜”假說，認(rèn)為中藥的起效機(jī)制是整體調(diào)節(jié)，中藥調(diào)治寒熱二證的物質(zhì)基礎(chǔ)應(yīng)是組成中藥的所有化學(xué)成分的整體協(xié)同作用［3］。

通過測定寒性、熱性中藥的HPLC圖譜，盡可能獲得其化學(xué)成分的整體信息，將有助于比較其物質(zhì)基礎(chǔ)的共性和差異。本實(shí)驗(yàn)選取藥性明確的二味寒性中藥（蒲公英、金銀花）和二味熱性中藥（干姜、仙茅），采用HPLC法測定，以未知成分的HPLC特征峰數(shù)據(jù)（總色譜峰數(shù)量和總色譜峰面積）為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選這四味中藥的提取方法，為后續(xù)的以HPLC圖譜表征寒性、熱性中藥的物質(zhì)信息奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（DAD檢測器，二元高壓梯度泵，柱溫箱;美國安捷倫公司）;KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）;Mettler AE 240電子天平（瑞士梅特勒公司）。

蒲公英Taraxacum mongolicumHand.Mazz.、金銀花Lon-icera japonicaThunb.藥材購自山東省臨沂市，干姜Zingiber officinaleRosc.、仙茅Curculigo orchioidesGaertn.藥材分別購自四川省犍為市和宜賓市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定，均為道地藥材;乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）;水為娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)對粉碎粒度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、甲醇濃度（D）等對提取效果影響較大的因素，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行考察，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.2 供試藥液的制備 分別取二味寒性中藥-蒲公英（1#）、金銀花（2#）、二味熱性中藥-干姜（3#）、仙茅（4#）粉末0.5 g各9份，按照表1設(shè)計(jì)的因素水平進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)，試驗(yàn)樣品編號見表2、表3，超聲提取，提取完畢，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用相應(yīng)濃度的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為HPLC供試藥液。

2.3 HPLC圖譜色譜條件的建立 色譜柱:Agilent XDB-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動相:乙腈-水（3 ∶97）→乙腈-水（100∶0），90 min，線性梯度洗脫;體積流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:35℃。檢測波長分別為1#:366 nm、2#:236 nm、3#:220 nm、4#:206 nm。

表2 二味寒性中藥正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 二味熱性中藥正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理 以各藥材供試液在相應(yīng)波長下的色譜峰總數(shù)量（total peak number，簡稱TPN）和色譜峰總面積（total peak area，簡稱TPA）為考察指標(biāo)。因各指標(biāo)變量單位和量綱不同且變量范圍相差懸殊，對不同性質(zhì)指標(biāo)直接加和不能正確反映不同作用力的綜合結(jié)果，故對這兩組數(shù)據(jù)按照公式（1）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理;將標(biāo)準(zhǔn)化后的各指標(biāo)數(shù)據(jù)求和，即得綜合評價(jià)值Y，寒性和熱性中藥樣品試驗(yàn)結(jié)果分別見表2、表3。

xi，j為第i個(gè)樣品的指標(biāo)j的測定值，j為1-9號樣品指標(biāo)j的平均測定值，x′i，j為第i個(gè)樣品的指標(biāo)j的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果見表2、表3。直觀分析結(jié)果表明，四味中藥皆以因素D（甲醇濃度）為主要影響因素，通過直觀分析優(yōu)選各藥味的最佳提取條件見表4。

表4 正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果

在正交設(shè)計(jì)中，如果沒有重復(fù)試驗(yàn)，又無空白項(xiàng)時(shí)，常取其中離均差平方和最小的因素項(xiàng)作為誤差估計(jì)，用以檢驗(yàn)其他因素作用的顯著性［4］。本實(shí)驗(yàn)采用SPSS11.5軟件對表2、表3中的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析［5］。首先不考慮試驗(yàn)誤差，將A、B、C、D四個(gè)因素都作為處理因素，進(jìn)行分析;根據(jù)分析結(jié)果，取各組數(shù)據(jù)分析結(jié)果中SS最小的因素作為誤差估計(jì)，檢驗(yàn)其它因素作用的顯著性，再次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析

經(jīng)方差分析可知，因素D（甲醇濃度）對4種中藥的提取效率均有顯著性影響，因素A（粉碎粒度）、B（提取時(shí)間）、C（提取溫度）對各味中藥的提取效率作用不顯著。為了統(tǒng)一提取方法，以便平行比較寒性、熱性中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的差異，綜合考慮各因素的影響，確定以A2B2C3對寒性、熱性中藥進(jìn)行提取。從表4可知，二味寒性中藥的最佳提取溶劑為50%甲醇。熱性中藥仙茅為70%甲醇;干姜雖為90%甲醇，但與70%甲醇提取效率相差不大。為了使提取液盡可能地反映寒性、熱性中藥物質(zhì)基礎(chǔ)信息，同時(shí)保證提取方法的一致性，確定同時(shí)用50%甲醇和70%甲醇兩種溶劑對2味寒性、2味熱性中藥進(jìn)行平行提取。綜上，4味中藥的最佳提取條件為:40目藥材粉末，平行采用50%和70%的甲醇，60℃水浴超聲提取30 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照以上確定的最佳提取條件，對4味中藥分別平行提取3批，測定其HPLC圖譜，計(jì)算其HPLC特征峰TPN和TPA，將其與正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)合并后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算綜合評價(jià)值Y，發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證試驗(yàn)綜合值Y均優(yōu)于正交試驗(yàn)的各次測定結(jié)果，見表6，證明該方法穩(wěn)定、可靠。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 關(guān)于藥性作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，若偏重于單一或幾種已知成分，將無法對其從整體上進(jìn)行把握。劉培勛等提出“中藥藥性物組學(xué)”觀點(diǎn)［6］，建議采用現(xiàn)代色譜、光譜技術(shù)，獲取中藥全化學(xué)成分的物質(zhì)組信息，以期闡明中藥藥性理論的本質(zhì)。針對不同藥性的中藥進(jìn)行分析、測定，獲取其盡可能全面的化學(xué)成分信息，進(jìn)而通過數(shù)據(jù)分析和信息挖掘，尋找寒性、熱性中藥化學(xué)信息的共性規(guī)律，可以有助于最終闡明寒性、熱性中藥藥性、藥效及物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過建立HPLC圖譜盡可能反映中藥的整體化學(xué)信息，對2味寒性、2味熱性中藥的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。

3.2 實(shí)驗(yàn)過程中，首先比較了回流提取與超聲提取的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)超聲提取的效率較高;其次分別對粉碎粒度、提取時(shí)間、提取溫度、甲醇濃度進(jìn)行單因素考察，發(fā)現(xiàn)粒度過細(xì)、時(shí)間過長、溫度過高對于提取效果并沒有太大影響;同時(shí)，當(dāng)甲醇濃度過低時(shí)（30%、40%），并不能提高提取液中色譜峰的數(shù)目和峰面積，反而會因甲醇濃度過低，提取液中多糖含量增加，不利于HPLC分析;據(jù)此設(shè)定了各因素的水平。

3.3 建立中藥藥性指紋圖譜，將有助于實(shí)現(xiàn)指紋圖譜特征和藥性相關(guān)性研究［7］。本實(shí)驗(yàn)在提取效率的評定指標(biāo)選取方面，基于中藥部分成分已知、大部分成分未知的現(xiàn)實(shí)，本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建供試藥液HPLC圖譜的基礎(chǔ)上，以其總色譜峰數(shù)量和總色譜峰面積為指標(biāo)，嘗試針對未知結(jié)構(gòu)的多成分的模糊數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，優(yōu)選寒性、熱性中藥的共性提取方法，較以往更加注重多種成分的群體效應(yīng)，為通過HPLC圖譜尋找不同藥性中藥物質(zhì)信息的共性規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

3.4 由于每味中藥所含成分各不相同，若HPLC分析時(shí)采用相同檢測波長難免會有失偏頗，故本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行全波長檢測，以色譜峰數(shù)量和色譜峰總面積為指標(biāo)，通過對光譜等勢圖的分析，優(yōu)選了對各味中藥供試液檢測靈敏度最高的檢測波長。

［1］鄧家剛，秦華珍，秦海洸.中藥藥性效應(yīng)及物質(zhì)基礎(chǔ)的文獻(xiàn)研究［J］.河南中醫(yī)，2007，27（5）:82-84.

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