刺玫果藥材中黃酮類成分測(cè)定

王光函， 姜 鴻， 張振秋， 尤獻(xiàn)民， 鄒桂欣*

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院遼寧沈陽(yáng)110034;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧大連116600)

中藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)是中藥現(xiàn)代化的瓶頸，中藥多成分的復(fù)雜性決定了單一成分或指標(biāo)評(píng)價(jià)難以表達(dá)中藥的質(zhì)量，并由此提出多成分質(zhì)量控制的模式［1-2］，本試驗(yàn)采用Agilent 1100高效液相色譜儀對(duì)刺玫果藥材中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素［3］4種成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，更有效的控制刺玫果藥材質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent1100，DAD檢測(cè)器，美國(guó))XS105電子天平(梅特勒-托利多中國(guó)地區(qū))。

1.2 試藥 蘆丁對(duì)照品(批號(hào):10080-200306)、金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào):1521-200202)、槲皮素對(duì)照品(批號(hào):10081-200406)、山柰素對(duì)照品(批號(hào):110861-200304)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。刺玫果的干果購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)。甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純，其余所用試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent SB C18(4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相:甲醇(D)，乙腈-四氫呋喃(1 ∶19)(C)，0.5%醋酸水(A)［4］，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。體積流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;柱溫:30℃。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 對(duì)照品HPLC圖

圖2 供試品HPLC圖

2.2 供試品溶液的制備 取刺玫果藥材(粉碎后)10 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流至提取液無(wú)色(約2 h)，棄去三氯甲烷液，藥渣揮去三氯甲烷，加甲醇繼續(xù)提取至無(wú)色(約4 h)，提取液蒸干，殘?jiān)酉∫掖既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液［5］。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素分別為 38.06 μg、162.65 μg、53.93 μg、4.994 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量與峰面積進(jìn)行線性回歸，回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)分別為:

蘆丁:Y=0.003X+0.000 5 r=0.999 8 線性范圍:0.038 1 ～0.456 7 μg

金絲桃苷:Y=0.011X+0.000 2 r=0.999 9 線性范圍:0.162 6 ～1.951 8 μg

槲皮素:Y=0.005X+0.000 3 r=0.999 9 線性范圍:0.053 7 ～0.647 4 μg

山柰素:Y=0.000 8X+0.000 2 r=0.999 8 線性范圍:0.005 ～0.059 9 μg

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液于配置后0、4、8、12 h時(shí)，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定各峰面積，計(jì)算蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD分別為1.56%、0.82%、1.23%和1.02%，表明穩(wěn)定性良好。

2.6 對(duì)照品精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，平行5次，測(cè)定峰面積。蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素的RSD分別為0.18%、0.22%、0.19%和0.18%，表明精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品10 g，5份，精密稱定，按供試液制備方法處理，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD分別為2.09%、2.00%、1.87%和1.81%，表明重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品5 g，5份，精密稱定，分別精密加入蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對(duì)照品適量，按供試液制備方法處理，分別計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率結(jié)果

2.9 樣品中黃酮的測(cè)定 精密吸取供試品溶液10 μL，每個(gè)樣品取3份，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以3次測(cè)定結(jié)果的平均值作為測(cè)定值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 曾采用Agilent紫外分光光度計(jì)對(duì)蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰素對(duì)照品溶液分別進(jìn)行掃描，4者在254 nm和360 nm下均有較大吸收，但是用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，供試品溶液在254 nm下基線不穩(wěn)，且干擾較多，故選擇360nm作為測(cè)定波長(zhǎng)［6］。

3.2 之前筆者曾采用等度洗脫系統(tǒng)對(duì)刺玫果中蘆丁和金絲桃苷進(jìn)行定量測(cè)定，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用梯度洗脫系統(tǒng)對(duì)黃酮類成分進(jìn)行測(cè)定，為更好的評(píng)價(jià)刺玫果藥材的質(zhì)量。

3.3 文獻(xiàn)報(bào)道，刺玫果總黃酮能降低腦血管阻力，增加冠脈血流量，提高小鼠耐缺氧能力［7-8］，且我國(guó)東北野生資源豐富，本試驗(yàn)選擇黃酮類成分進(jìn)行測(cè)定，為刺玫果資源的客觀評(píng)價(jià)提供依據(jù)［9-10］。

3.4 中藥化學(xué)成分多樣且復(fù)雜，在指標(biāo)選擇方面，應(yīng)開(kāi)展質(zhì)量標(biāo)示性指標(biāo)與內(nèi)在質(zhì)量性指標(biāo)相結(jié)合的方法研究，即應(yīng)選擇多指標(biāo)質(zhì)量控制的方法。實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多指標(biāo)成分的控制，也有助于說(shuō)明藥物的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，使中藥新藥研究逐漸明確其所含化學(xué)成分并控制其量和穩(wěn)定性。這與現(xiàn)階段新法規(guī)［11-13］對(duì)中藥新藥研究的要求是一致的，在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尤其是新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，應(yīng)努力向建立多指標(biāo)定量測(cè)定的方向發(fā)展，盡可能實(shí)現(xiàn)對(duì)多種不同工藝、多種指標(biāo)成分的定量測(cè)定控制，多方面控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高現(xiàn)代中藥制劑的質(zhì)量控制水平。

［1］王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測(cè)多評(píng)”法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2006，31(23):1925-1928.

［2］王躍生.中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化發(fā)展現(xiàn)狀與思考［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(12):1108-1110.

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［11］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于實(shí)施《藥品注冊(cè)管理辦法》有關(guān)事宜的通知.國(guó)食藥監(jiān)注［2007］596號(hào)［S］.2007-09-26.

［12］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)中藥注冊(cè)管理補(bǔ)充規(guī)定的通知.國(guó)食藥監(jiān)注［2008］3號(hào)［S］.2008-01-07.

［13］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求的通知.國(guó)食藥監(jiān)注［2007］743號(hào)［S］.2007-12-06.