HPLC-ELSD測(cè)定八珍益母丸中水蘇堿的含量

蔣 歆， 丁永輝， 魏學(xué)冰， 楊 錫

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000;2.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅蘭州730000;3.甘肅省藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州730000)

八珍益母處方源于明代張景岳《景岳全書》，并被解放后歷版《中國(guó)藥典》收載。處方由益母草、黨參、白術(shù)(炒)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、白芍(酒炒)、川芎、熟地黃組成，用于氣血兩虛兼有血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、月經(jīng)周期錯(cuò)后、行經(jīng)量少、淋漓不凈［1］等癥。其中益母草為君藥，為唇形科植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)的干燥全草，水蘇堿為益母草的主要成分之一，且含量較大。中國(guó)藥典對(duì)益母草及益母草膏中水蘇堿的含量作為指標(biāo)成分采用薄層掃描法進(jìn)行測(cè)定［2］，操作煩瑣，誤差較大。本文采用HPLC-ELSD法測(cè)定八珍益母丸中水蘇堿的含量，操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性較好，可作為八珍益母丸中水蘇堿含量測(cè)定的新方法。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀;Waters 2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;KQ250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);德國(guó)Sartorius R200D型分析天平(十萬(wàn)分之一);上海梅特勒AE240型分析天平(萬(wàn)分之一);鹽酸水蘇堿對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào):110712-200508);八珍益母丸(批號(hào)為 090310、090311、090312)，乙腈(色譜純，DIKMA公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件［3］

色譜柱:Venusil HILIC 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20);流速:0.5 mL/min;柱溫:35℃，ELSD檢測(cè)器:載氣(N2)氣體流速:流速2.8 L/min，飄移管溫度105℃，霧化室溫度:80℃，增益值為135，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取在105℃干燥至恒重的鹽酸水蘇堿12.68 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含0.253 6 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取八珍益母丸研細(xì)，稱取1 g，置于50 mL三角瓶中，加乙醚30 mL，回流0.5 h，棄去乙醚液，殘?jiān)右掖?0 mL回流提取30 min，過(guò)濾，殘?jiān)盀V器用10 mL乙醇沖洗，濾液置水浴上濃縮約至干，殘?jiān)靡掖既芙獠⒍ㄈ葜? mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

根據(jù)樣品處方，制備不含益母草的陰性樣品，照供試品溶液的制備項(xiàng)同法操作，即可。

2.5 方法的專屬性考察

在上述色譜條件下，水蘇堿峰與其他成分分離良好，陰性對(duì)照樣品試驗(yàn)，結(jié)果表明提取物中其它成分對(duì)水蘇堿的測(cè)定無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1，以水蘇堿峰計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)為8 200。

2.6 線性關(guān)系的考察

取對(duì)照品溶液 4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0、30.0 μL分別進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，鹽酸水蘇堿對(duì)照品(0.253 6 mg/mL)進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(μg)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:lgA=4.729 2+1.005 6lgC，r=0.999 3(n=8)，線性范圍為1.014 4 ～7.608 0 μg。

圖1 八珍益母丸HPLC-ELSD

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 日內(nèi)精密度

取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10 μL，對(duì)峰面積進(jìn)行考察，RSD為1.52%。

2.7.2 日間精密度

取對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，每天進(jìn)樣兩針，考查3天。測(cè)得鹽酸水蘇堿峰面積RSD為1.84%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的八珍益母丸(批號(hào):090304)，平行取樣6份，按2.3項(xiàng)方法操作并檢測(cè)。結(jié)果鹽酸水蘇堿平均含量為0.398 8(mg/g)，RSD為1.96%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取0.253 6 mg/mL鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液及供試品溶液，于 0、1、2、4、8、12 h 按上述色譜條件分別進(jìn)樣 20 μL，按鹽酸水蘇堿峰面積計(jì)算RSD值分別為0.2%、1.8%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液均在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，分別精密稱取已測(cè)知含量(批號(hào)090304，0.398 8 mg/g)的樣品，按2.3項(xiàng)法操作并檢測(cè)。各進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.11 樣品測(cè)定

取3批供試品，同2.3項(xiàng)供試品溶液的制備處理 ，制成供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液20 μL，對(duì)照品溶液5 μL及20 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算樣品中水蘇堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇 取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果在201 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，已低于甲醇等常用流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)，不宜用紫外檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，而用通用型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)［4-5］進(jìn)行檢測(cè)可得到較好的分離。

3.2 樣品的提取 八珍益母丸提取物組分復(fù)雜，根據(jù)水蘇堿不溶于乙醚、氯仿的特性，樣品提取時(shí)加乙醚30 mL，回流半小時(shí)，棄去乙醚液，除去醚溶性成分，殘?jiān)右掖?0 mL回流提取30 min，過(guò)濾，置水浴上濃縮至干，乙醇定容至5 mL，使樣品得到較好的富集和凈化。

3.3 流動(dòng)相的選擇 采用不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等多種溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果以乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20)作為流動(dòng)相，色譜圖峰型好，出峰時(shí)間適宜，分離效果較好。

3.4 試驗(yàn)中考查不同漂移管溫度、霧化室溫度和氣體流速對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響，結(jié)果表明在漂移管溫度105℃，霧化室溫度80℃，載氣體積流量2.8 L/min時(shí)測(cè)量的靈敏度較高，且穩(wěn)定性較好，故本試驗(yàn)采用此條件作為測(cè)量條件。

3.5 色譜柱選擇［6-7］由于鹽酸水蘇堿極性較大，使用傳統(tǒng)的反相色譜流動(dòng)相通常在死時(shí)間流出而無(wú)法得到分離，而親水性色譜柱(HILIC)能為強(qiáng)極性的化合物提供合適的保留，所以本實(shí)驗(yàn)選擇穩(wěn)定性好的親水性丙基酰胺鍵合硅膠(Venusil-HILIC，100?，4.6 mm ×250 mm，5 μm，VH952505-0)對(duì)水蘇堿進(jìn)行分離，取得了較好的分離效果。

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