高效液相色譜法測(cè)定蒲地藍(lán)消炎片中咖啡酸、綠原酸的含量

邵禮梅，李延雪，王云龍

黑龍江省雞西市藥品檢驗(yàn)所，黑龍江雞西 158100

蒲地藍(lán)消炎片為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]收載品種，由蒲公英、黃芩、板藍(lán)根、苦地丁四味中藥組成，具有清熱解毒、抗炎消腫的功效，用于癤腫、腮腺炎、淋巴腺炎、扁桃腺炎等。方中蒲公英有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效[2]，其有效成分含咖啡酸、綠原酸。蒲公英作為方中的君藥，原標(biāo)準(zhǔn)中沒有含量測(cè)定項(xiàng)。為完善質(zhì)量控制，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[1,3-5]采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒲地藍(lán)消炎片中咖啡酸、綠原酸的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A高效液相色譜儀 （島津)：LC-2010紫外檢測(cè)器，在線脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，LCsolution色譜工作站，色譜柱為AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；AG285電子分析天平、KQ-400KDE型超聲波清洗器。

1.2 試藥

對(duì)照品綠原酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753-200413），咖啡酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110885-200102）；蒲地藍(lán)消炎片（批號(hào)：091110、20100701、101101）；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶液（5∶5∶90）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。 理論塔板數(shù)咖啡酸峰不低于6 000，綠原酸峰不低于4 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取咖啡酸對(duì)照品10.81 mg與綠原酸對(duì)照品10.12 mg，分別置于10 ml量瓶中，加50%甲醇適量使其溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液A、B。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液A 1 ml、B 0.3 ml置于同一100 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度制成對(duì)照品混合溶液C（濃度：咖啡酸 10.810 μg/ml，綠原酸 3.036 μg/ml），用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約4片重，精密稱定，置50 ml錐形瓶中，精密加入5%甲酸、50%甲醇溶液25 ml，密塞，精密稱定，超聲處理（功率 400 W，頻率 40 kHz）30 min，取出，放冷，精密稱定，用5%甲酸、50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方量并以相同工藝制備缺蒲公英的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品混合溶液C 2.0、4.0、8.0、10.0、16.0、20.0、24.0 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定綠原酸、咖啡酸峰面積積分值。以進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得綠原酸、咖啡酸回歸方程分別為：Y綠原酸=34 014X+370.76，r綠原酸=1.000 0；Y咖啡酸=60 125X+288.55，r咖啡酸=1.000 0。 結(jié)果表明：綠原酸在 0.607 2～7.286 4 μg/ml，咖啡酸在 2.162～25.944 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μl，測(cè)定綠原酸、咖啡酸峰面積，綠原酸峰面積平均值為102 694.6，RSD為0.29%；咖啡酸峰面積平均值為649 473.4，RSD為0.07%（n=5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該條件下綠原酸、咖啡酸精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品（批號(hào)：20100701）溶液，在0、2、4、8、12、16、24 h 分別進(jìn)樣 10 μl，記錄峰面積，結(jié)果 7 次進(jìn)樣綠原酸峰面積的平均值為87 011.1，RSD為1.84%（n=7）；咖啡酸峰面積的平均值為795 789，RSD為0.90%（n=7）。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取樣品 （批號(hào)：20100701）5份，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣后記錄綠原酸、咖啡酸的峰面積，綠原酸、咖啡酸的峰面積RSD值分別為0.62%、1.93%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 陰性對(duì)照試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品、陰性對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定（圖1），在陰性對(duì)照色譜圖中，與咖啡酸、綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)位置的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，表明其他組分對(duì)其測(cè)定無干擾。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20100701，平均片重 0.245 5 g，綠原酸含量為 16.22 μg/片，咖啡酸含量為82.12 μg/片）0.49 g共6份，分別精密加入綠原酸（15.41 μg/ml）、咖啡酸（78.01 μg/ml）對(duì)照品溶液各 2 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μl，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取3批不同廠家的市售樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中綠原酸、咖啡酸的含量（表2）。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

對(duì)于超聲提取，本試驗(yàn)對(duì)溶劑種類進(jìn)行了考察，50%甲醇、5%甲酸50%甲醇溶液、5%甲酸甲醇溶液；超聲時(shí)間考察了20、30、40 min，結(jié)果5%甲酸50%甲醇溶液提取30 min效果較好。故采用5%甲酸50%甲醇溶液提起30 min作為前處理?xiàng)l件。

3.2 流速的選擇

流速對(duì)分離效果影響較大，本實(shí)驗(yàn)考察了0.8、1.0、1.2 ml/min共3個(gè)流速，結(jié)果表明，選擇0.8 ml/min的流速得到的分離效果最佳。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第三冊(cè))[S].北京：人民衛(wèi)生出版社,1991：187.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010：331.

[3]管玉云,方慶,程正.抗菌消炎片中綠原酸的含量測(cè)定[J].安徽醫(yī)藥,2008,12(9)：797-798.

[4]張才煜,孫權(quán),劉敬閣.不同地區(qū)蒲公英中咖啡酸的含量測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(9)：776-777.

[5]周玲娜,吳立成,陳宗良.高效液相色譜法測(cè)定消炎片中綠原酸的含量[J].中國(guó)藥業(yè),2009,18(10)：35.