Ki67、VEGF、nm23在乳腺癌組織中表達的相關性及臨床意義

謝春華， 楊基鵬， 劉 崢， 任大宏

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率出現(xiàn)明顯上升趨勢，尤其在國內(nèi)一些大中城市，已躍居女性惡性腫瘤的首位，嚴重威脅婦女身心健康[1]。目前研究已發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞增殖及凋亡的異常有關，是一個多基因、多步驟、多階段的復雜過程，包括抑癌基因失活與癌基因的激活[2]。Ki67是一種與增殖細胞周期相關的核抗原，能夠識別存在于增殖細胞核基質(zhì)內(nèi)的核蛋白，反映腫瘤細胞的增殖活性，是目前腫瘤研究中的熱點。本研究采用組織芯片技術(shù)與免疫組化方法，檢測乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中Ki67、VEGF與nm23的表達情況，結(jié)合患者的臨床病理資料，分析他們之間的相關性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例選自我院2006年1月至2010年12月間收治的120例原發(fā)性乳腺癌，均為女性，年齡31～82歲，中位年齡50.2歲。術(shù)前患者均未接受化療、放療以及內(nèi)分泌等治療。按照1997年UICC(國際抗癌聯(lián)盟)TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期93例，Ⅲ～Ⅳ期27例。其中有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。病理類型均為浸潤性導管癌。

1.2 主要試劑 Ki67、VEGF、nm23鼠抗人單克隆抗體濃縮液，免疫組織化學PV9000通用型二步法檢測試劑盒，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒，均購自北京中杉生物技術(shù)公司?？贵w工作濃度1∶20。

1.3 檢測方法 所有組織標本經(jīng)10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后制作4×10點陣組織芯片，切片厚4 μm，帖附于涂有APES處理過的載玻片上，60℃烤片2 h。免疫組化按照試劑盒操作步驟進行，以已知陽性組織切片為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀 不同生物學指標在細胞中的著色部位不同。Ki67以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，VEGF與nm23以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。顯微鏡下各取5個高倍鏡視野，各記數(shù)100個細胞，結(jié)果按陽性細胞所占細胞比例的平均值定義為陽性細胞百分比。陽性細胞數(shù)<10%為陰性；陽性細胞數(shù)在10%～25%為弱陽性(+)；陽性細胞數(shù)在26%～50%為陽性(++)；陽性細胞數(shù)>50%為強陽性(+++)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關分析。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki67、VEGF、nm23在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達(見表1) 120例乳腺癌組織中有89例Ki67呈陽性表達，陽性表達率為74.2%。而在癌旁正常乳腺組織中未見Ki67陽性表達，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。VEGF在乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為78.3%、10.8%，與Ki67的表達趨勢相似。而nm23在乳腺癌與癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為4.2%和77.5%，趨勢與Ki67、VEGF相反，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中Ki67、VEGF、nm23的表達

2.2 乳腺癌組織中Ki67、VEGF與nm23表達的相關性(見表2) 經(jīng)Spearman秩相關分析，Ki67表達與VEGF、nm23無顯著相關性(P>0.05)。

表2 乳腺癌組織中Ki67與VEGF、nm23表達的相關性

2.3 Ki67、VEGF、nm23表達與乳腺癌臨床病理因素間的關系(見表3、4) 乳腺癌組織中Ki67表達與患者臨床分期顯著正相關(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無顯著相關(P>0.05)。VEGF表達與患者臨床分期及腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)也顯著正相關(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小也無相關性(P>0.05)。nm23的表達與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈顯著負相關(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小以及臨床分期無相關性(P>0.05)。并且，Ki67與VEGF的共同表達與乳腺癌腫瘤大小及臨床分期顯著相關(P<0.05)。

表3 Ki67、VEGF、nm23表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

注： * 表示P<0.05

表4 Ki67、VEGF共同表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多步驟、多階段的復雜過程，與細胞增殖或分化異常有關，某些分子標志物的表達與否和表達高低能夠反映腫瘤細胞分化的程度。增殖細胞核抗原(Ki67) 是一種能識別存在于增殖細胞核基質(zhì)內(nèi)的核蛋白，能夠有效評估腫瘤細胞增殖活性的重要標記物，是目前判斷腫瘤侵襲力和腫瘤預后的最可靠的指標[3-5]。

研究表明Ki67與腫瘤細胞的周期性變化密切相關，其參與了腫瘤細胞異常增生、惡變，使細胞間同質(zhì)性粘附力降低、浸潤力增強，促進新生血管生長等整個病理過程。其功能和細胞的有絲分裂有關，在G1晚期/S早期呈微量表達，S期聚集，尤其在后半期表達率明顯增高，有絲分裂后期迅速降解或失去抗原決定簇，脫離細胞周期后迅速降解，半衰期短，因此其表達水平的高低可以反映腫瘤細胞增殖狀態(tài)，對評價腫瘤的生物學行為、判斷其危害性具有重要意義[6]。已有的研究表明在多種惡性實體腫瘤中Ki67的表達率遠高于正常組織，其表達與惡性腫瘤的分化程度及浸潤轉(zhuǎn)移等有關[7-8]。

本研究顯示，Ki67在乳腺癌組織中的陽性表達率為74.2%，與Bhatavdekar等[9]的報道結(jié)果相似。同時，Ki67陽性表達與乳腺癌臨床分期呈正相關，即臨床分期越晚，Ki67陽性表達越高，進一步表明Ki67是反映乳腺癌生物學行為的可靠指標，可以作為判斷腫瘤細胞增殖狀態(tài)及評價乳腺癌預后的生物學指標。有關Ki67表達與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系是目前研究的熱點之一，本研究結(jié)果卻顯示Ki67表達與患者腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無顯著相關(P>0.05)，與李寶江等[10]的研究結(jié)果一致，尚有待于大樣本的進一步研究。此外，本研究結(jié)果還顯示，Ki67表達與患者年齡、腫瘤大小亦無顯著相關性(P>0.05)。

VEGF是一種特異性促使血管內(nèi)皮細胞增殖的由多種亞型組成的多家族蛋白質(zhì)，在正常組織中常常低水平表達，而在實體惡性腫瘤中則高表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中VEGF陽性表達率為78.3%，顯著高于癌旁正常乳腺組織。并且有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的VEGF陽性表達率明顯高于腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者(P<0.05)，表明VEGF表達與乳腺癌的浸潤及轉(zhuǎn)移之間存在密切聯(lián)系，其可能是VEGF能夠促進淋巴管生成，而新生的淋巴管壁較薄，使癌細胞容易透過管壁進入淋巴循環(huán)，從而造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果還顯示，Ki67與VEGF起協(xié)同作用，兩者共表達與乳腺癌腫瘤大小及臨床分期呈正相關性，這與Nakopoulou等[11]的研究結(jié)果一致。可能是癌細胞在惡性增殖過程中有較多新生血管發(fā)生，而VEGF是血管生成的主要調(diào)控因子，能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，加快細胞的有絲分裂，從而促進腫瘤的生長。

nm23是從轉(zhuǎn)移潛力不同的鼠黑色素瘤中分離出來的一種被認為與腫瘤轉(zhuǎn)移能力相關的基因，編碼的蛋白產(chǎn)物為核苷二磷酸激酶(NDPK)，是一種能催化多種反應具有復雜生物學功能的酶，主要通過影響微管裝配、信號傳導、轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)及細胞粘附而維持細胞的正常分裂狀態(tài)，從而抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移。本研究顯示nm23在乳腺癌組織中呈低表達，而在正常乳腺組織中呈高表達，淋巴轉(zhuǎn)移與nm23表達呈負相關(P<0.05)，此與文獻報道基本一致[12-13]。

綜而述之，Ki67的陽性表達作為衡量乳腺癌細胞增殖狀態(tài)及判斷預后的重要指標已經(jīng)得到驗證，而聯(lián)合檢測VEGF、nm23的表達情況，對于指導乳腺癌臨床分期及確定臨床治療方案具有重要意義。應用組織芯片技術(shù)，結(jié)合免疫組化方法，可以高質(zhì)量地檢測乳腺癌組織中多項生物學指標，為乳腺癌的臨床病理評估提供幫助，更有助于正確分析乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的高危因素，為判斷預后和個體化治療提供理論依據(jù)。

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