BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞表達(dá)OPG和RANKL的影響

[摘要]目的:研究BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞表達(dá)OPG和RANKL的影響。方法:第5代人牙囊細(xì)胞免疫組化染色，檢測(cè)人牙囊細(xì)胞中OPG和RANKL蛋白的表達(dá);第5代人牙囊細(xì)胞與濃度為100 ng/ml的BMP-2共同孵育0h、1h、3h、6h、12h、18h，RT-PCR法檢測(cè)OPG和RANKL基因表達(dá)的變化。結(jié)果:人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL免疫組化染色陽性;100 ng/ml的BMP-2上調(diào)OPG蛋白的分泌，最佳效應(yīng)時(shí)間為12～18h，下調(diào)RANKL基因的表達(dá)，最佳效應(yīng)時(shí)間為6～12h。結(jié)論:人牙囊細(xì)胞存在OPG、RANKL蛋白的表達(dá);100ng/ml的BMP-2可增強(qiáng)人牙囊細(xì)胞OPG蛋白分泌和基因表達(dá)，減弱RANKL基因的表達(dá)，降低RANKL/OPG的比值，抑制破骨細(xì)胞的形成。

[關(guān)鍵詞]骨形成蛋白-2;人牙囊細(xì)胞;骨保護(hù)素;破骨細(xì)胞分化因子

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)09-1313-04

Effects of BMP-2 on the expressions of OPG and RANK in the human dental follicle cells

SUN Hai-yan1，ZHANG Yong-kuan2，JIN Zuo-lin3，LIN Zhu3

(1.Department of Stomatology，the 307th Hospital of PLA，Beijing 100071，China; 2.Department of Stomatology，the 150th Hospital of PLA，Luoyang 471031，Henan，China; 3.Department of Orthodontics，the Fourth Millitary Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Objective:To study the effects of BMP-2 on the expressions of OPG and RANKL in the human dental follicle cells.MethodsThe expressions of OPG and RANKL were examined in the 5th passage human dental follicle cells by immunohistochemical staining technique.The human dental follicle cells were co-cultured with 100 ng/ml BMP-2 for 0，1h，3h，6h，12h，18h，then the expressions of OPG and RANKL were assayed by Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). ResultsThe immunohistochemical staining of OPG and RANKL was positive. 100ng/ml BMP-2 up regulated the expression of OPG and the optimal time was 12h～18h，down regulated the expression of RANKL and the optimal time was 6h～12h.ConclusionsOPG and RANKL are expressed in human dental follicle cells. 100ng/ml BMP-2 up regulate the expression of OPG and down regulate the expression of RANKL.The decrease of RANKL/OPG inhibits osteoclastogenesis.

Key words: BMP-2;OPG;human dental follicle cells;RANKL

牙囊組織起源于外胚間充質(zhì)，是包繞成釉器周圍的疏松結(jié)締組織，在牙齒萌出和牙周組織形成中起重要作用，缺乏牙囊的牙齒不能萌出，而單核細(xì)胞在牙囊的聚集以及單核細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞、進(jìn)而吸收牙槽骨、形成牙齒萌出通道是牙齒萌出的關(guān)鍵。這個(gè)過程受許多細(xì)胞因子的調(diào)控，如集落刺激因子-1(CSF-1)、甲狀旁腺相關(guān)蛋白(PTHrP)、骨保護(hù)素(OPG)、破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)等，這些因子直接或者間接誘導(dǎo)單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊。而牙齒萌出的過程伴隨萌出牙齒冠方、根方牙槽骨的代謝，成骨與破骨在骨代謝中是密不可分的，骨形成蛋白-2(BMP-2)作為一種重要的成骨相關(guān)蛋白，在這個(gè)過程中又是如何發(fā)揮作用的呢?

本實(shí)驗(yàn)通過青少年第三磨牙牙囊細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，證明了人牙囊細(xì)胞中存在OPG和RANKL基因的表達(dá);并分析BMP-2對(duì)人牙囊細(xì)胞中OPG和RANKL基因表達(dá)的影響;結(jié)果有助于闡明牙齒萌出的分子機(jī)制，也為臨床阻生牙的正畸矯治以及牙胚的組織工程研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器:DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，USA);胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司);胰蛋白酶(GIBCO公司，進(jìn)口分裝);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific公司，USA);YJ-875型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠);倒置顯微鏡及照像系統(tǒng)(Olympus，Japan);高速低溫離心機(jī)(湖南湘雅儀器儀表總廠);BMP-2(Peprotech公司，USA);羊抗人OPG、RANKL抗體(Santa Cruz，USA);二抗試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司);OPG ELISA試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司);TRIzol Reagent (Life Technologies， NY);RNA抽提試劑盒;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，USA);DNA marker(DGL-2000，北京天為時(shí)代);Taq DNA聚合酶、dNTPs、和引物 (上海生物工程公司);瓊脂糖(Sigma，USA);PCR儀(MJ Research，USA);凝膠成像分析儀(Vitber tourmat公司，法國(guó));核酸蛋白定量分析儀(Eppendorf公司，德國(guó))

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL蛋白的表達(dá):取第5代人牙囊細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%時(shí)，用40g/L多聚甲醛固定10min，爬片用PBS振洗5 min×3次后，3ml/L的Triton-X 100 滴在爬片上10min，增加細(xì)胞通透性;然后滴30ml/L的H2O2，37℃孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;滴加羊血清在37℃條件下封閉15min;不洗，分別滴加羊抗人OPG、RANKL多克隆抗體后入濕盒4℃過夜，次日37℃復(fù)溫1h，滴加二抗，37℃孵育15 min;滴加辣根過氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育15min;以上每步之后用PBS振洗5min×3次，然后DAB顯色，光鏡控制。用PBS液替代一抗設(shè)立空白對(duì)照，其余步驟不變。經(jīng)蘇木精復(fù)染，逐級(jí)脫水透明后封片。

1.2.2RT-PCR法檢測(cè)BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響

1.2.2.1 人牙囊細(xì)胞的處理:取第5代的人牙囊細(xì)胞，用2.5g/l的胰蛋白酶消化后，配成單細(xì)胞懸液，接種到直徑為70mm的培養(yǎng)皿上，加含50ml/L FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液5ml，次日去除未貼壁死細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合后，換含10ml/l FBS的DMEM培養(yǎng)3h后，加100ng/ml的BMP-2分別于0 h、1h、3h、6h、12 h、18h終止培養(yǎng)。

1.2.2.2 總RNA提取及檢測(cè):根據(jù)TRIzol Reagent產(chǎn)品說明提取總RNA，每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞加1ml Trizol提取總RNA，室溫作用5min后收集細(xì)胞樣品，加入氯仿0.2ml充分混勻后室溫作用2～3min，4℃下12 000r/min 離心15min，收集水相，加入0.5ml異丙醇混勻后室溫作用10min。而后4℃下12 000r/min 離心10min，再用75%乙醇洗滌后，4℃下以7 500r/min離心5min，空氣中自然干燥RNA后，用無RNA酶水溶解，取出少量稀釋后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。根據(jù)測(cè)定值調(diào)整RNA標(biāo)本濃度為1μg/μl，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA第一鏈合成及擴(kuò)增:根據(jù)Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 操作說明將5μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)條件為:94℃變性3min，94℃ 變性30s，58℃～59℃退火2s，4℃延伸30s，72℃延長(zhǎng)5min，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)，

1.2.4 引物序列及參數(shù):見表1。

1.2.5PCR產(chǎn)物分析:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μl點(diǎn)樣于10g/L瓊脂糖凝膠， DL2000 Maker10μl作參照，80V電壓下電泳，于紫外線箱中觀察并照相記錄。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用Bandscan 5.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。以樣品的OPG或RANKL的灰度值與同一樣品β-actin的灰度值之比作為評(píng)價(jià)OPG或RANKL表達(dá)量的指標(biāo)，數(shù)據(jù)采用方差分析，應(yīng)用SPSS11.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測(cè)體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL蛋白的表達(dá):人牙囊細(xì)胞胞漿中微弱表達(dá)OPG，空白組無表達(dá)，微弱表達(dá)RANKL，空白組無表達(dá)，如圖1～5所示。

2.2BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG、RANKL表達(dá)的影響:如圖5、表2所示BMP-2作用下HDFCs的OPG基因表達(dá)隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，12h基因表達(dá)處于高峰(P<0.05)，18h略有回落，RANKL的基因表達(dá)則相反，隨時(shí)間逐漸下降，6h時(shí)表達(dá)降低顯著(P<0.05)，持續(xù)到12h，達(dá)到最低，以后略有回升。

3討論

OPG屬于腫瘤壞死因子受體(TNF-R)超家族，以外分泌的方式在胞外發(fā)揮作用，在體外OPG可以阻止破骨細(xì)胞(OC)的分化。OPG mRNA廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞。

破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)mRNA 主要表達(dá)在骨、骨髓和淋巴組織。表達(dá)于成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞表面的RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的破骨細(xì)胞分化激活受體(RANK)結(jié)合，刺激前體破骨細(xì)胞分化，活化成熟的破骨細(xì)胞，引起骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)RANKL基因敲除小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨質(zhì)硬化和牙萌出困難，體內(nèi)破骨細(xì)胞數(shù)明顯減少[1-2]。而OPG是RANKL的可溶性餌受體，競(jìng)爭(zhēng)性的與RANKL結(jié)合，阻斷RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞性骨吸收和誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡

從前的觀點(diǎn)認(rèn)為是OPG而不是RANKL表達(dá)于大鼠下頜第一磨牙的牙囊上[3]。他們的研究發(fā)現(xiàn)大鼠出生后第3天、小鼠出生后第5天第一磨牙OPG表達(dá)下降，在體外牙囊細(xì)胞與CSF-1和PTHrP共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)OPG的表達(dá)下降，因此可以推測(cè)CSF-1和PTHrP是OPG表達(dá)下降的原因，此時(shí)OPG基因表達(dá)減弱，增大了RANKL/OPG，使萌出牙周圍牙槽骨表達(dá)的RANKL發(fā)揮更大的作用，導(dǎo)致了大量的破骨細(xì)胞出現(xiàn)[3]。但是新近的研究結(jié)果證明牙囊細(xì)胞也存在RANKL的表達(dá)[4]，牙周膜也同時(shí)表達(dá)OPG和RANKL，也證明了牙囊細(xì)胞與牙周膜細(xì)胞的延續(xù)性。研究發(fā)現(xiàn)大鼠出生后第1～8天RANKL的表達(dá)沒有明顯變化，第9～11天出現(xiàn)一個(gè)小高峰，而OPG無明顯變化，RANKL/OPG也升高，此時(shí)體內(nèi)出現(xiàn)相應(yīng)破骨細(xì)胞小高峰，而且體外研究發(fā)現(xiàn)，RANKL的表達(dá)受TNF-α、IL-1α、TGF-β的影響而增強(qiáng)[4]，但是IL-1α和TGF -β在出生后早期表達(dá)于星網(wǎng)狀層，而此時(shí)RANKL的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，推測(cè)可能是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻或者可能通過其他渠道影響破骨細(xì)胞形成。體外實(shí)驗(yàn)還證明BMP可以增強(qiáng)OPG的表達(dá)，降低RANKL的表達(dá)，推測(cè)BMP參與了根方牙槽骨的形成。

骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)屬于轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-βs)超家族成員，是一種多功能的生長(zhǎng)因子，對(duì)胚胎骨形成及出生后成骨有重要的作用，BMP-2是一種刺激骨形成的蛋白，可上調(diào)成骨細(xì)胞系OPG的表達(dá)， BMP-2對(duì)牙囊細(xì)胞的作用，使它成為牙齒萌出過程中促進(jìn)根部牙槽骨形成的刺激因子[5]。Zhao等[6]用BMP-2作用于永生化的鼠牙囊細(xì)胞，能誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞向成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型分化。Pan K等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)BMP-2可以上調(diào)小鼠牙囊細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)。Morsczeck等[8]用胰島素和地塞米松作用于體外培養(yǎng)的人牙囊細(xì)胞，提高了細(xì)胞的BMP-2的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)得到BMP-2可上調(diào)體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞OPG的分泌，下調(diào)RANKL的表達(dá)，結(jié)果從另一個(gè)側(cè)面反映了BMP-2對(duì)人牙囊細(xì)胞向成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化的促進(jìn)作用。因此可以大致認(rèn)為除了在牙齒發(fā)育和萌出的特定時(shí)期某些細(xì)胞因子會(huì)下調(diào)OPG的分泌和上調(diào)RANKL的表達(dá)，其余的狀態(tài)下牙囊細(xì)胞以及隨后發(fā)育而來的牙周膜細(xì)胞會(huì)保持RANKL和OPG的動(dòng)態(tài)平衡[9-10]，這可以保證在非牙齒萌出的特定時(shí)期牙槽骨保持正常狀態(tài)。

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[收稿日期]2010-06-05 [修回日期]2010-08-16

編輯/張惠娟