杜仲對(duì)UVA致HaCaT細(xì)胞光老化保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的:研究杜仲不同提取部位抗UVA致HaCaT細(xì)胞光老化的作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法:杜仲乙醇提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂制備不同濃度乙醇梯度洗脫部位，分別作用于HaCaT細(xì)胞光老化模型，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、MDA、SOD活力，確定并篩選杜仲抗皮膚光老化的作用及有效部位。結(jié)果:與模型組相比，濃度為1255μg/ml的50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位能提高細(xì)胞活性(P<0.05)，使培養(yǎng)液中LDH降低(P<0.01)、SOD活力提高(P<0.05)、MDA活力降低(P<0.05);濃度為125μg/ml的水洗脫部位使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力降低(P<0.05)。結(jié)論:杜仲抗皮膚光老化作用的有效成分主要集中在50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位，其作用機(jī)制可能與其能清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞膜免受損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]杜仲;光老化;HaCaT細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)09-1316-03

Protective effects of UVA induced photoaging in HaCaT cell by Eucommia ulmoides

LI Jian-min，XU Yan-ming，CHEN Qiao-yun，QI Yong-hua，ZHANG Ning

(School of Jiamusi，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveTo research the resistance effects to ultraviolet radiation induced photoaging in HaCaT cell by different extract fractions from Eucommia ulmoides， and preliminarily discuss its functional mechanisms.MethodsEthanol extract of Eucommia macroporous resin were prepared by different parts of the concentration gradient of ethanol. Cell morphous was observed by inverted microscope; cell activeness was measured by MTT; values of LDH， MDA and SOD in culture solution were detected. And finally the anti-photoaging constitutes of Eucommia ulmoides were screened and confirmed.ResultsCompared to model group， 50% elution site (the concentration of 1255μg/ml) could enhance cell activeness (P<0.05)， increase the value of SOD (P<0.05) and reduce the values of LDH (P<0.01) and MDA (P<0.05) in culture solution. 0% elution site (the concentration of 125μg/ml) could reduce the value of LDH (P<0.05) in culture solution.ConclusionsThe active constitutes of Eucommia ulmoides for skin anti-photoaging effects are mostly concentrated in 50% ethanol macroporous resin elution. The mechanisms are probably related to clearing oxygen free radicals and protecting cell membrane damages.

Key words: Eucommia ulmoides;photoaging;HaCaT cell

皮膚光老化是指由于長(zhǎng)期的日光照射導(dǎo)致皮膚加速衰老的現(xiàn)象，日光中的紫外線(UV，主要為UVA和UVB)是導(dǎo)致皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的重要因素?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲具有促進(jìn)膠原合成、抗衰老的作用，這些作用可能與杜仲的抗氧化活性有關(guān)[2]。本課題組前期工作表明，杜仲大孔樹(shù)脂富集物能夠抵抗UVB輻射引起的細(xì)胞氧化損傷，具有抗皮膚光老化的潛力。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)UVA劇烈照射與UVB一樣，也能產(chǎn)生紅斑和血管損傷，甚至引起的改變比UVB更為嚴(yán)重，只是產(chǎn)生這種效應(yīng)所需的劑量較UVB大1000倍，可見(jiàn)，UVA在皮膚光老化發(fā)病中同樣起著重要作用。因此，本課題組在前期工作的基礎(chǔ)上，對(duì)杜仲抗UVA致HaCaT細(xì)胞光老化作用進(jìn)行研究，更加全面評(píng)價(jià)杜仲抗皮膚光老化的作用。

1材料和方法

1.1材料:人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT(武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，MEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，胎牛血清(Sigma公司)，乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、丙二醛測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2儀器:UVA紫外光療儀(Sigma公司)，離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(上海熱電儀器有限公司)，Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus株式會(huì)社)，生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，小容量恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器有公司)，半自動(dòng)生化分析儀(四川美生科技有限公司)。

1.3 細(xì)胞光老化模型的建立:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞單層貼壁后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl PBS，進(jìn)行UVA照射，劑量為30J/cm2，空白組用鋁箔蓋住[3-5]。按公式1[6]計(jì)算紫外線的照射劑量，照射強(qiáng)度通過(guò)紫外線輻照計(jì)測(cè)量來(lái)測(cè)定。

照射劑量(J/cm2)=照射強(qiáng)度(W/cm2)×照射時(shí)間(s)……公式1

1.4 藥物的制備:取杜仲70%乙醇提取濃縮制得的浸膏，上D101大孔吸附樹(shù)脂，經(jīng)乙醇梯度洗脫得到水洗脫部位、50%洗脫部位，冷凍干燥后用MEM完全培養(yǎng)液溶解，配制成濃度為1μg/ml的藥液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌，4℃保存，備用。臨用時(shí)以MEM完全培養(yǎng)液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度，濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

1.5分組及給藥:將對(duì)數(shù)期HaCaT細(xì)胞接種于96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分為空白對(duì)照組、模型組、給藥組，各組細(xì)胞均設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組:HaCaT細(xì)胞給予不含藥MEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h;模型組:HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)24h，30J/cm2的UVA照射后，給予不含藥的MEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h;給藥組:HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)24h，30J/cm2的UVA照射后分別給予500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml 4個(gè)濃度不同藥物的MEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。

1.6指標(biāo)觀測(cè)

1.6.1細(xì)胞形態(tài):用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.6.2細(xì)胞活性:向每孔(含100μl培養(yǎng)液)加入20μl濃度為5μg/ml的MTT，孵育4h，棄上清，加入150μl DMSO，置恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在492nm處吸光值(OD值)。按公式2計(jì)算細(xì)胞活性。

細(xì)胞活性=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%……公式2

1.6.3 LDH、SOD、MDA測(cè)定:按LDH、SOD、MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)處理:由SPSS 13.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響:倒置顯微鏡可觀察到空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)一致，邊界清楚，排列緊密。模型組細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞貼壁性降低，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞變圓或不規(guī)則，細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞裂解成細(xì)胞碎片，并有大量漂浮細(xì)胞。與模型組相比，125μg/ml的50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位給藥組細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)細(xì)胞活性的影響:結(jié)果見(jiàn)表1，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞活性顯著降低，二者具有顯著性差異(P<0.01)，表明造型成功;而50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位在500μg/ml時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，表明藥物濃度太大，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，細(xì)胞存活率降低。與模型組相比，50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位在125μg/ml時(shí)，細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05);水洗脫部位4個(gè)劑量組細(xì)胞活性均無(wú)明顯提高;表明50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位能夠在一定程度上抵抗UVA對(duì)細(xì)胞活性的抑制。

2.3 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力的影響:結(jié)果見(jiàn)表2，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著升高(P<0.01)，表明造模型成功;而50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位在500μg/ml時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著升高(P<0.01)，表明藥物濃度太大，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，引起細(xì)胞LDH的泄漏。與模型組相比，50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位在125μg/ml時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著降低(P<0.01);水洗脫部位在125μgoml-1時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力明顯降低(P<0.05);表明50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位和水洗脫部位均能夠降低UVA輻射引起的HaCaT細(xì)胞LDH的泄漏量，而50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位作用更加顯著。

2.4 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA活力的影響:結(jié)果見(jiàn)表2，與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力明顯降低(P<0.05)，MDA活力明顯升高(P<0.05)，表明造模型成功;而50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位在500μg/ml時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力顯著降低(P<0.01)，MDA活力顯著升高(P<0.01)，表明藥物濃度太大，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，使細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重。與模型組相比，50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位在125μg/ml時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力明顯升高(P<0.05)，MDA活力明顯降低(P<0.05);水洗脫部位對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA活力均無(wú)明顯影響;表明50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位能夠抵抗UVA輻射引起的細(xì)胞氧化損傷。

以上結(jié)果表明，50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位能提高細(xì)胞活性(P<0.05)，使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH顯著降低(P<0.01)、SOD活力明顯提高(P<0.05)、MDA活力明顯降低(P<0.05);水洗脫部位僅使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力明顯降低(P<0.05);提示杜仲抗皮膚光老化作用的有效成分主要集中在50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位。

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杜仲50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位可通過(guò)提高SOD活力，加速氧自由基的清除和減少氧自由基的產(chǎn)生，使UVA所致的HaCaT細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度得以降低。同時(shí)，50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位可以降低UVA作用的HaCaT細(xì)胞LDH活力，減輕其所致細(xì)胞的不可逆損害。其機(jī)制可能是杜仲通過(guò)抗氧化作用，維持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，LDH的漏出減少;至于杜仲是否有直接地抑制LDH合成或加速LDH代謝的作用尚待進(jìn)一步的研究。水洗脫部位僅對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活力有一定作用，暫時(shí)不對(duì)其進(jìn)行深入研究。

任何化學(xué)物達(dá)到一定濃度時(shí)均可引起器官、組織或細(xì)胞損傷。預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)500μg/ml的給藥劑量為毒性劑量，故我們選擇了該范圍內(nèi)的4個(gè)濃度(500、250、125、62.5μg/ml)進(jìn)行研究。

結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)杜仲50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位對(duì)UVA和UVB[7]致HaCaT細(xì)胞光老化均有良好的保護(hù)作用，可以確定50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位是抗皮膚光老化的有效部位。但50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位仍是一個(gè)復(fù)合物，其抗皮膚光老化活性成分仍不清楚。在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以利用HaCaT細(xì)胞進(jìn)行體外生物活性指導(dǎo)下的有效成分的分離分析，使確定50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位中的有效單體結(jié)構(gòu)以及后續(xù)結(jié)構(gòu)改造成為可能。50%乙醇大孔樹(shù)脂洗脫部位抗皮膚光老化的成分、分子機(jī)制等有待進(jìn)一步研究。本研究為杜仲抗衰防皺功效型產(chǎn)品的研制以及我國(guó)杜仲資源的二次開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，為中藥抗皮膚光老化的現(xiàn)代研究提供方法學(xué)借鑒。

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[收稿日期]2010-06-06[修回日期]2010-08-20

編輯/張惠娟