細胞共培養(yǎng)技術(shù)在美白藥物研究中的應(yīng)用及前景

隨著生活水平的提高，人們對生活質(zhì)量的要求越來越高，越來越重視皮膚的自然美白。運用細胞培養(yǎng)技術(shù)從中藥中尋找安全、有效的脫色劑已成為研究的主要方向[1-2]。目前，所用的細胞實驗?zāi)Ｐ陀幸环N細胞的單獨培養(yǎng)、兩種或兩種以上細胞的共培養(yǎng)。單獨培養(yǎng)一種細胞未考慮體內(nèi)其他細胞對其產(chǎn)生的作用，而細胞共培養(yǎng)彌補了這方面的不足，讓研究者能夠使用更符合生理學特點的模型來進行一系列研究[3-5]。本文就細胞共培養(yǎng)技術(shù)篩選美白藥物的發(fā)展現(xiàn)狀及前景綜述如下。

1細胞共培養(yǎng)的方法

細胞共培養(yǎng)技術(shù)目前應(yīng)用的方法可分為單層混合共培養(yǎng)技術(shù)、非接觸式共培養(yǎng)技術(shù)和組織工程支架技術(shù)。單層共培養(yǎng)是將兩種以上細胞放入同一器皿中共同培養(yǎng)的方法，非接觸式共培養(yǎng)是通過Transwell小室來實現(xiàn)的。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下室以聚碳酸酯膜相隔，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。組織工程支架技術(shù)是將在體外培養(yǎng)、擴增的正常組織細胞種植到具有良好生物相容性且在體內(nèi)可逐步降解吸收的組織工程多孔支架上，使細胞在支架上增殖、分化[6]?，F(xiàn)階段美白藥物篩選常用的是單層混合共培養(yǎng)技術(shù)，非接觸式共培養(yǎng)還未見用于美白藥物篩選，而組織工程支架技術(shù)中的皮膚類似物將可能成為發(fā)展方向。

2細胞共培養(yǎng)技術(shù)在美白藥物篩選領(lǐng)域的應(yīng)用及發(fā)展

黑素合成和轉(zhuǎn)運的每一個過程都有著精細的調(diào)控機制，其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的異常，都有可能引起皮膚色素異常性改變[7-9]。黑素生成是發(fā)生于黑素細胞的細胞器黑素小體，此過程包括黑素小體的形成和在L-酪氨酸酶作用下轉(zhuǎn)化成為黑素的生化途徑。酪氨酸酶是這一生物合成過程的關(guān)鍵酶，其活性與黑素合成量密切相關(guān)，控制其活力即可控制黑素生成量。因此，可通過抑制酪氨酸酶活性和黑素生成量來篩選美白藥物，黑素細胞單獨培養(yǎng)或黑素細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)將是美白中藥篩選的有效途徑。

大量學者嘗試通過黑素細胞單獨培養(yǎng)來篩選能夠使黑素合成、轉(zhuǎn)運受阻的美白藥物。楊壯群等[1，10-12]均通過單獨培養(yǎng)黑素細胞篩選出有些中藥提取物可以抑制酪氨酸酶活性、降低黑素含量，表明單獨培養(yǎng)黑素細胞是一種篩選美白藥物行之有效的方法。但隨著對皮膚構(gòu)造的深入了解，研究者意識到與黑素細胞相連的角質(zhì)形成細胞對其發(fā)揮的作用不容忽視，羅增香等[13]通過中藥單體蛇床子素、黃芩苷對黑素合成的研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)體系中藥物對黑素合成的抑制作用強于單獨培養(yǎng)的黑素細胞，說明了兩種培養(yǎng)方法確實存在差別。由于細胞共培養(yǎng)體系更接近正常人皮膚的真實構(gòu)造，得出的數(shù)據(jù)更有說服力，所以研究者便把篩選藥物的方法從黑素細胞單獨培養(yǎng)向黑素細胞和角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)過度，而更接近人體皮膚結(jié)構(gòu)的皮膚類似物也有希望成為美白藥物篩選的新方法。

2.1單層混合共培養(yǎng)的應(yīng)用:單層混合共培養(yǎng)是將所研究的不同種類的細胞在同一培養(yǎng)器皿中混合培養(yǎng)。它提供了類似體內(nèi)的復(fù)雜微環(huán)境，包括細胞與細胞間的接觸反應(yīng)和細胞因子的作用。由于其操作簡便，目前廣泛應(yīng)用于模擬人表皮微環(huán)境的實驗研究。1988年，Halaban[14]首次成功地將黑素細胞和角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)，驗證了該模型的可行性。馬慧軍等[15]也成功建立了人表皮原代黑素細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)的體外模型，為美白藥物的篩選提供了可行的方法。仲少敏等[16]選取85種生藥醇提物和水提物在 melan-a 與SP-1 共培養(yǎng)體系做實驗研究，熊果苷作為陽性對照，結(jié)果川芎、威靈仙、桂枝、麥冬、白果、蒿本、紅花、白蘇葉的醇提物，五倍子的水提物在細胞培養(yǎng)水平對黑素生成有明顯抑制作用，強于相同濃度熊果苷的作用，這一結(jié)果可為美白藥物篩選提供依據(jù)。蘭海龍等[17]以人包皮組織作為細胞來源，體外構(gòu)建黑素細胞與角質(zhì)形成細胞直接接觸的混合培養(yǎng)模型，檢測蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后對黑素細胞酪氨酸酶活性以及黑素合成的影響，發(fā)現(xiàn)三種單體均對黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成產(chǎn)生濃度依賴性抑制，初步闡明了美白藥物的作用機理。解士海[4] 通過建立人表皮黑素細胞-角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)的體外模型，研究了丹皮酚、苦參堿、氧化苦參堿、大黃素等中藥單體對黑素合成過程的影響，結(jié)果表明通過觀察黑素小體的轉(zhuǎn)運證明了共培養(yǎng)模型的成功建立;熊果苷、丹皮酚、苦參堿劑量依賴性抑制共培養(yǎng)體系中黑素小體的轉(zhuǎn)運;大黃素、氧化苦參堿對于黑素小體的轉(zhuǎn)運無影響，表明丹皮酚具有很好的美白應(yīng)用開發(fā)前景，大黃素及苦參堿有待進一步研究。左付國[9]建立了人的黑素細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)模型，研究了熊果苷和淫羊藿苷兩種中藥單體對黑素小體轉(zhuǎn)運的影響及其可能的作用機制，發(fā)現(xiàn)熊果苷可通過誘導(dǎo)黑素細胞樹突退縮，抑制黑素小體的轉(zhuǎn)運，這一研究結(jié)果為熊果苷作為美白藥物提供了一項新的依據(jù)。

2.2皮膚類似物的應(yīng)用前景:單層混合共培養(yǎng)模型可以對美白藥物進行有效的篩選，但Tae-Jin Yoon 等[18]通過實驗證明了黑素瘤細胞或黑素細胞單獨培養(yǎng)或是與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)得到的數(shù)據(jù)與三維皮膚類似物的均有不同，而皮膚類似物更能準確地表現(xiàn)組織學構(gòu)造，所以皮膚類似物模型，有望用于中藥美白藥物的大范圍篩選，提高工作效率。人類正常皮膚主要以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主，其中Ⅰ型膠原含量最多，由于膠原分子結(jié)構(gòu)中含有大量的雙羧基及雙氨基氨基酸和碳水化合物，適于細胞的粘附;膠原又是一種廣泛存在于動物皮膚、肌腱和其他結(jié)締組織中的天然蛋白質(zhì)，來源廣泛。因此，在膠原重組膜上接種人黑素細胞和角質(zhì)形成細胞可以建立皮膚類似物模型。Lee等[19]利用含角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的皮膚類似物模型檢測化合物光毒性，結(jié)果顯示光生物學效應(yīng)與天然皮膚很接近;Damour等[20]很早便指出組織工程皮膚將成為評估化妝品原料及產(chǎn)品皮膚刺激、光毒性、光保護等特征的有用工具，這都為皮膚類似物模型成為篩選美白中藥的有效途徑提供了依據(jù)。楊穎颙等[21-22]分別從胎牛皮和大鼠鼠尾腱中提取膠原纖維，再經(jīng)處理制成生物相容性良好的膠原作為支架，在支架材料上種植成纖維細胞構(gòu)建皮膚類似物模型。楊壯群等[23-24]通過人永生化表皮細胞(HaCaT)和黑素細胞共培養(yǎng)體系接種在鼠尾膠原凝膠支架上構(gòu)建皮膚類似物模型。張鐵良等[25]將鼠尾膠原溶液、濃縮培養(yǎng)基、NaOH溶液和以血清重懸的成纖維細胞溶液在適當?shù)谋壤禄旌虾笮纬赡z構(gòu)建真皮類似物。劉源等[26]也運用組織工程方法以包皮組織作為細胞來源構(gòu)建含有黑素細胞的皮膚類似物模型。雖然以上皮膚類似物模型的建立多是用于研究皮膚缺損的修復(fù)，美白中藥篩選還未有人使用這種模型，但由于皮膚類似物模型有可能與人皮膚組織融合，將使得中藥美白藥物篩選的數(shù)據(jù)更加可靠，篩選方法更加有效，可以作為美白藥物篩選的新嘗試。

3小結(jié)

現(xiàn)今，通過細胞共培養(yǎng)技術(shù)篩選美白藥物已成為研究的熱點。細胞共培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)歷了單層細胞的接觸、非接觸式共培養(yǎng)到三維皮膚類似物，共培養(yǎng)方法已日趨成熟。單層細胞共培養(yǎng)由于操作簡單適合于實驗室中藥物篩選的研究，而且該模型接近真實的人體生理環(huán)境，使研究者能夠更好地觀察細胞與細胞、細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機制和可能作用的靶點，填補了一種細胞單獨培養(yǎng)和整體動物實驗的空白[27]，用此方法已篩選出了許多有效的中藥提取物，有些已用于美白產(chǎn)品中。而三維皮膚類似物模型由于已驗證了它與人類缺損皮膚的融合能力，證明了它與正常人皮膚具有良好的相似度，用該模型進行藥物篩選得到的結(jié)果將更具有可信度。如果能夠商品化皮膚類似物，將為中藥美白藥物的篩選提供一個更方便、快捷、有效的途徑[28]。共培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展給研究者帶來了新的機遇與挑戰(zhàn)，在研究者的共同努力下將會得到更加方便、有效的藥物篩選方法。

[參考文獻]

[1]楊壯群，王正輝，荔 鵬，等.蘆薈苦素對體外培養(yǎng)的黑素細胞影響的實驗研究[J].中國美容醫(yī)學，2003，12(05):464-466.

[2]雷鐵池，朱文元，夏明玉，等.中藥對黑素生物合成影響研究:82 味中藥乙醇提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用[J].中草藥，1999，30(5):336-339.

[3]解士海，陳志強，馬鵬程，等.人表皮黑素細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)體外模型中黑素小體轉(zhuǎn)運的觀察[J].臨床皮膚科雜志，2006，35(5):286-288.

[4]解士海.人表皮黑素細胞-角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)及 11 種化合物對黑素沉著的影響研究[D].中國協(xié)和醫(yī)科大學，2006.

[5]Yoon TJ，Hearing VJ.Co-culture of mouse epidermal cells for studies of pigmentation[J].Pigment Cell Research，2003，16(2):159-163.

[6]吳林波，丁建東.組織工程三維多孔支架的制備方法和技術(shù)進展[J].功能高分子學報，2003，16(1):91-96.

[7] Dell'Anna ML，Picardo M.A review and a new hypothesis for non-immunological pathogenetic mechanisms in vitiligo[J].Pigment Cell Research，2006，19(5):406-411.

[8]Lin JY，F(xiàn)isher DE.Melanocyte biology and skin pigmentation[J].Nature，2007，445(7):843-850.

[9]左付國. Rho-GTPase 調(diào)節(jié)人黑素細胞和 B16 黑素瘤細胞樹突生成和黑素轉(zhuǎn)運的作用研究[D].復(fù)旦大學，2009.

[10]涂彩霞，張榮鑫，劉亞玲，等.18 味中藥乙醇提取物對小鼠 B16 黑素瘤細胞增殖及黑素生成的影響[J].中華皮膚科雜志，2006，39(7):400-402.

[11]李 利，周 敏，周光平，等.川芎嗪對正常人黑素細胞黑素合成的抑制作用[J].中國皮膚性病學雜志，2003，17(3):157-158.

[12]高桂華，徐華娥，李慶平，等.白藜蘆醇對惡性黑色素瘤生長抑制作用的體外及體內(nèi)研究[J].南京醫(yī)科大學學·自然科學版，2009，6:790-793.

[13]羅增香，項蕾紅，李 劍，等.兩味中藥單體對人黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影響[J].中國麻風皮膚病雜志，2008，24(8):583-585.

[14]Halaban R，Langdon R，Birchall N，et al.Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes[J].JCell Biolog，1988，107(4):1611.

[15]馬慧軍，田 燕，劉 雯，等.人表皮黑素細胞與 HaCaT 細胞共培養(yǎng)體外模型的建立[J].中國美容醫(yī)學，2009，18(2):188-190.

[16]仲少敏，吳 艷，趙俊郁，等.中藥抑制黑素生成作用的篩選研究[J].中國美容醫(yī)學，2006，15(6):703-706.

[17]蘭海龍，王正輝，楊壯群，等.蘆薈苦素對黑素細胞與角質(zhì)形成細胞混合培養(yǎng)模型中黑素合成的影響[J].中國美容醫(yī)學，2007，16(3):310-313.

[18]Yoon TJ，Lei TC，Yamaguchi Y，et al.Reconstituted 3-dimensional human skin of various ethnic origins as an in vitro model for studies of pigmentation[J].Analytical biochemistry，2003，318(2):260-269.

[19]Lee JH，Kim JE，Kim BJ，et al.In vitro phototoxicity test using artificial skin with melanocytes[J].Photodermatology，Photoimmunology Photomedicine，2007，23(2-3):73-80.

[20]Damour O，Augustin C，Black AF，et al.Applications of reconstructed skin models in pharmaco-toxicological trials[J].Medical and Biological Engineering and Computing，1998，36(6):825-832.

[21]楊穎颙，于淑賢，賈繼章，等.利用膠原構(gòu)建皮膚組織工程支架的研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2003，17(4):339-342.

[22]胡葵葵，戴育成，袁敬東，等.利用膠原構(gòu)建皮膚組織工程支架的研究[J].江西醫(yī)學院學報，2005，45(6):28-31.

[23]楊壯群，王正輝，屠軍波，等.體外構(gòu)建色素化皮膚類似物模型[J].南方醫(yī)科大學學報，2007，27(11):1670-1673.

[24]曹玉萍，周武慶，馬鵬程，等.用 HaCaT 細胞和正常人黑素細胞構(gòu)建組織工程皮膚[J].毒理學雜志，2009，5:341-344.

[25]張鐵良，屠軍波，楊壯群，等.以鼠尾膠原為支架的真皮類似物的建立[J].中國美容醫(yī)學，2006，15(2):131-133.

[26]劉 源，金 巖，王新文，等.構(gòu)建含黑色素細胞組織工程皮膚的研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2003，17(6):501-503.

[27]常 艷，魏 偉.細胞共培養(yǎng)及其應(yīng)用的研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2009，14(7):827-832.

[28]Yoon TJ，Lei TC，Yamaguchi Y，et al.Reconstituted 3-dimensional human skin of various ethnic origins as an in vitro model for studies of pigmentation[J].Analytical biochemistry，2003，318(2):260-269.

[收稿日期]2010-07-19 [修回日期]2010-08-31

編輯/李陽利