熊果苷對(duì)A375細(xì)胞與HACAT共培養(yǎng)模型中黑素合成的影響

[摘要]目的:體外構(gòu)建研究色素問題的黑素瘤細(xì)胞(A375)與角質(zhì)形成細(xì)胞(HACAT)直接接觸的共培養(yǎng)模型，利用熊果苷對(duì)此共培養(yǎng)體系進(jìn)行驗(yàn)證。方法:MEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)A375細(xì)胞與HACAT細(xì)胞，A375細(xì)胞與HACAT以1:2的比例共培養(yǎng)，構(gòu)建黑素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞直接接觸的共培養(yǎng)模型;將不同濃度熊果苷作用于此模型，用MTT法、多巴氧化法及NaOH裂解法檢測(cè)熊果苷對(duì)細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素合成的影響。結(jié)果:A375細(xì)胞與HACAT能共同存活，1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.2mg/ml熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖、黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有較強(qiáng)的劑量相關(guān)的抑制作用，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建了A375細(xì)胞與HACAT細(xì)胞直接接觸的共培養(yǎng)模型;脫色藥熊果苷作用于本模型后引起酪氨酸酶及黑素的變化與預(yù)期結(jié)果一致;本模型為進(jìn)一步研究色素問題奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]共培養(yǎng)模型;黑素瘤細(xì)胞;角質(zhì)形成細(xì)胞;熊果苷

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)09-1321-03

Effect of Arbutin on the in vitro model of the Melanoma Cells and keratinocyte co-culture system

WANG Xing-yan，WANG Tian-ye，CHEN Qiao-yun，ZHANG Ning，LI Shao-min，CHEN Jing-hua

(Department of Cosmetology of TCM，Jiamusi College，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveTo Establish the in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes，and observe the effect of Arbutin on pigmentation in co-culture model of melanoma cells and keratinocytes.MethodsWe cultivated the melanoma cells and keratinocytes respectively and then constructed the mixed cultivating model of them.After arbutin was added to the model，celludar proliferation，tyrosinase activity and melanin content were measured by MTT assay，L-DOPA oxidation assay and NaOH assay respectively.ResultsThe in vitro co-culture model of melanoma cells and keratinocytes was established successfully The proliferation of co-culture cells，tyrosinase activity and the melanin synthesis were markedly suppressed by arbutin in a dose-dependent manner.The significant suppression was observed with 1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.2mg/ml of arbutin than that with control.ConclusionWe have successfully constructed the co-culture model of melanoma cells and keratinocytes， Arbutin known to inhibit melanogenesis were examined using the co-culture model and the results were consistent with expectations. This model provide requirement for further study.

Key words:co-culture model;melanoma cells;keratinocytes;Arbutin

黑素是決定皮膚顏色的最主要因素，在黑素細(xì)胞的特征性細(xì)胞器-黑素小體中合成。生理情況下一個(gè)黑素細(xì)胞與周圍約36個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞相接觸，構(gòu)成表皮黑素單位[1]，黑素代謝是一個(gè)發(fā)生于黑素細(xì)胞(MC)與角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)之間并主要由角質(zhì)形成細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子調(diào)控的完整的過程。自1982年Eisinger和Marko[2]體外培養(yǎng)皮膚MC成功以來，黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究中，包括退色素藥物的篩選、機(jī)理、療效及毒性的研究。然而這種黑素細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)未考慮體內(nèi)其它鄰近細(xì)胞對(duì)黑素細(xì)胞的影響。1988年Halaban[3]首次成功地建立了體外模擬“表皮黑素單元”的黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型，使研究者得以使用更接近皮膚生理學(xué)特點(diǎn)的模型來開展一系列研究。研究結(jié)果[4-6]表明KC-MC共培養(yǎng)體系下針對(duì)影響黑素代謝藥物篩選的結(jié)果不同于單獨(dú)培養(yǎng)黑素細(xì)胞基礎(chǔ)上的篩選結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了KC-MC共養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)“表皮黑素單元”結(jié)構(gòu)，用公認(rèn)的脫色藥熊果苷作用于本模型，觀察本模型對(duì)熊果苷作用的反應(yīng)是否與預(yù)期一致，驗(yàn)證本模型能否用于脫色素藥物的篩選及機(jī)理研究。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人黑素瘤細(xì)胞株(A375)由中國科學(xué)院細(xì)胞中心提供;人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HACAT細(xì)胞)購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2試劑與儀器:MEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、雙抗(Billab公司);二甲基亞砜、甲基噻唑四唑、L-dopa、TritonX-100、熊果苷(購于Sigma公司);磷酸緩沖鹽(北京中杉金橋有限公司)。離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);酶標(biāo)儀(上海熱電儀器有限公司);Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus株式會(huì)社);生物潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);小容量恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器有公司);超低溫冰箱(Thermo Electron Corporation);CO2孵育箱(上海智成分析儀器制造有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黑素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng)模型的建立:常規(guī)培養(yǎng)A375細(xì)胞及HACAT細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期生長狀態(tài)良好的A375細(xì)胞及HACAT細(xì)胞消化、離心、MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，按A375細(xì)胞與HACAT細(xì)胞比例為1:2將兩種細(xì)胞懸液混合。每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞取自同一原瓶。

1.2.2分組及給藥:實(shí)驗(yàn)分給藥組、陰性對(duì)照組和空白組。給藥組熊果苷的濃度分別0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml;陰性對(duì)照組直接加培養(yǎng)基;空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。以空白孔調(diào)零，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.2.2細(xì)胞增殖活性測(cè)定:將混合后的細(xì)胞用含10%FBS和1%雙抗的MEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104個(gè)/ml，按每孔200μl接種至96孔板，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12h。細(xì)胞貼壁后換含不同濃度熊果苷的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h加5mg/ml的MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，倒扣法去除培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，將培養(yǎng)板置于微孔板震蕩器震蕩10min，使結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀490nm測(cè)定吸光度值。細(xì)胞增殖活性用A490值表示。

1.2.3 酪氨酸酶活性測(cè)定:將混合后細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×104個(gè)/ml，按每孔200μl接種至96孔板培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)基，換含不同濃度熊果苷的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。用pH7.4的0.01M的PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100μl，迅速置-80℃冰箱內(nèi)放置30min后，之后室溫下融化，充分裂解細(xì)胞。37℃預(yù)熱，加入0.5%L-DOPA溶液50μl/孔，于37℃下反應(yīng)3h，以490nm波長測(cè)定各孔OD值，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每一處理因素重復(fù)3次。酪氨酸酶活性用A490值表示。

1.2.4 黑素含量的測(cè)定:采用Hunt[7]法測(cè)定黑素量。共培養(yǎng)細(xì)胞以4.5×104/ml，接種6孔板，每孔2ml(約90 000個(gè)細(xì)胞)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，給藥組用含不同濃度熊果苷的新鮮培養(yǎng)液換液1次，對(duì)照組只加培養(yǎng)基;繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶0.5ml/孔消化后，加入1mlMEM中止消化，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液收集到10ml離心管中，1 500r/min離心5min，棄去上清液，然后加入100μl濃度為1mol/L NaOH，37℃水浴lh，充分裂解細(xì)胞和溶解黑素顆粒。加入400μl雙蒸水釋稀，充分混勻后，100μl/孔分別加至96孔板，置酶標(biāo)儀測(cè)OD值，波長為490nm。每一處理因素重復(fù)3次。黑素含量用A490值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析:所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各處理組與對(duì)照組多重比較用方差分析。

2結(jié)果

2.1 黑素瘤細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞混合培養(yǎng):Hacat細(xì)胞與A375細(xì)胞可共同存活，A375細(xì)胞呈梭形、雙極、三極或多分支樹突狀。Hacat細(xì)胞呈近似菱形，簇集成團(tuán)。如圖1。

2.2 熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量的影響:見表1。

由表1可見，熊果苷濃度≥0.2mg/ml時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);熊果苷濃度≤0.1mg/ml時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞增值無明顯影響。熊果苷對(duì)共培養(yǎng)模型中酪氨酸酶活性呈劑量依賴性抑制。熊果苷濃度≥0.2mg/ml時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞中酪氨酸酶活性有顯著抑制作用，與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);熊果苷濃度≤0.1mg/ml時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞中酪氨酸酶活性無明顯影響。熊果苷對(duì)共培養(yǎng)模型中黑素合成呈劑量依賴性抑制。熊果苷濃度≥0.2mg/ml時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞中黑素合成有顯著抑制作用，與陰性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);熊果苷濃度≤0.1mg/ml時(shí)，對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞黑素合成無明顯影響。

3討論

脫色藥熊果苷對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的人黑素瘤細(xì)胞株(A375)黑素合成的抑制作用已得到證明[8]，而本實(shí)驗(yàn)用A375細(xì)胞與人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HACAT)混合培養(yǎng)模型，將公認(rèn)的脫色藥熊果苷以不同濃度作用于此模型發(fā)現(xiàn):A375與HACAT在混合培養(yǎng)時(shí)可共同存活;脫色藥熊果苷作用于此模型可劑量依賴性抑制抑制酪氨酸酶活性和黑素合成。本研究結(jié)果與解士海[9]利用正常人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型研究熊果苷美白機(jī)理所得結(jié)果相似。李杰等[10]利用該模型研究了中藥方“白消一號(hào)”治療白癜風(fēng)的機(jī)理發(fā)現(xiàn)白消一號(hào)能促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成。結(jié)合上述兩位研究者的結(jié)果說明本模型能反映脫色藥物對(duì)黑素代謝的影響，可用于脫色素藥物的篩選及其作用機(jī)理的研究。本模型中所用細(xì)胞能無限傳代細(xì)胞，較原代培養(yǎng)的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞容易獲得和培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果苷抑制黑素合成的濃度與其抑制黑素細(xì)胞的增殖的濃度基本一致，說明其美白作用主要與其細(xì)胞毒性有關(guān)，與宋琦如[11]的研究結(jié)果相同。但0.5mg/ml及0.2mg/ml熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞增殖的抑制程度低于對(duì)黑素合成抑制程度(與相應(yīng)對(duì)照組比分別為P<0.05，P<0.01)，0.5mg/ml熊果苷對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞增殖的抑制程度小于其對(duì)酪氨酸酶的抑制程度(與相應(yīng)對(duì)照組比分別為P<0.05，P<0.01)，說明脫色藥熊果苷的美白機(jī)理還與其抑制酪氨酸酶活性和(或)影響黑素合成的其它環(huán)節(jié)有關(guān)。

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[收稿日期]2010-06-17[修回日期]2010-08-18

編輯/張惠娟