siRNA c-Met腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)人外泌汗腺上皮細(xì)胞增殖的影響

[摘要]目的:研究siRNA c-Met腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)培養(yǎng)的人外泌汗腺上皮細(xì)胞(human eccrine sweat gland epithelial cells，hESGc)增殖的影響。方法:按我科已經(jīng)建立的方法培養(yǎng)和鑒定hESGc，取第1代細(xì)胞備用。構(gòu)建表達(dá)紅色熒光蛋白的siRNA c-Met腺病毒， 熒光顯微鏡觀察和Westernlot檢測證實(shí)病毒的有效性。MTT法檢測siRNA c-Met腺病毒對(duì)hESGc增殖的影響。結(jié)果:熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染了siRNA c-Met腺病毒的hESGc有紅色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞進(jìn)行westernblot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA c-Met腺病毒轉(zhuǎn)染能抑制hESGc細(xì)胞中c-Met蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)70%以上，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA c-Met腺病毒能抑制hESGc增殖，抑制率分別為16.8%(2天)和34.5%(4天)。結(jié)論:siRNA c-Met腺病毒轉(zhuǎn)染能抑制hESGc的增殖。

[關(guān)鍵詞]c-Met;外泌汗腺;上皮細(xì)胞;增殖

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)09-1324-03

Inhibitory effects of knockdown of c-Met by Adenovirus-delivered siRNA on growth of human eccrine sweat gland epithelial cells

LEI Xia1， LIU Bo2， WU Jin-jin1， LU Yuan-gang1， Yang Ya-dong1

(1. Department of Dermatology， Daping Hospital，Third Military Medical University， Chongqing， 400042，China;2. Department of Orthopadics， the First Affiliated Hospital， Chongqing Medical University)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effect of siRNA c-Met adenovirus on proliferation of cultured hESGc.Methods The recombinant adenoviral vector containing siRNA targeting c-Met gene was successfully constructed. Adenovirus with high titer was harvested. Fluorescence microscope observation and westernblot test were used to confirm the effectiveness of adenovirus. MTT assay was used to detect the growth of the cells.ResultsRed fluorescence was observed in hESGc infected with siRNA c-Met adenovirus under fluorescence microscopy.The infected cells were harvested for westernblot test. It is observed that c-Met was inhibited in siRNA c-Met adenovirus infected cell group. The transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc by MTT assay.The inhibition rate were 16.8% in 2 days and 34.5% in 4 days.ConclusionThe transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc.

Key words:c-Met; eccrine sweat gland; epithelial cell; proliferation

C-Met是至今唯一被認(rèn)識(shí)的肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)高親和力受體，由c-Met基因編碼，HGF與c-Met結(jié)合后，可誘導(dǎo)其發(fā)生構(gòu)像變化，進(jìn)而激活磷酸化通路，逐級(jí)放大信號(hào)，從而發(fā)揮HGF的生物學(xué)效應(yīng)。不少實(shí)驗(yàn)表明，HGF/c-Met信號(hào)通路與多種細(xì)胞增殖，器官發(fā)生，腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)[1]。已有實(shí)驗(yàn)表明，人外泌汗腺上皮細(xì)胞(Human Eccrine Sweat Gland Epithelial Cells，hESGc)上存在c-Met受體，加入HGF能促進(jìn)hESGc增殖[2]，但下調(diào)c-Met表達(dá)對(duì)hESGc的影響尚不明確。RNA干擾是一種新興的基因抑制技術(shù)，原理是通過設(shè)計(jì)小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)，介導(dǎo)序列高度同源的靶基因mRNA降解，下調(diào)靶基因表達(dá)[3]。本文擬利用重組腺病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)下調(diào)c-Met表達(dá)對(duì)hESGc體外增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑:無血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium，KSFM)和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司， FITC-Annexin V試劑盒購自美國Trevigen公司，抗Marker 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品和兔抗c-Met多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，鼠抗β-actin 抗體購自美國Novus 公司，其他分子生物學(xué)試劑購自美國Sigma 公司，pSES-HUS及腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1， 由美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室TC. He教授惠贈(zèng);限制性內(nèi)切酶Sfi I， EcoRV， KanI， PmeI，PacI和T4 DNA連接酶 購自美國TaKaRa 公司和New England Biolabs(NEB)公司，Wizard Plus質(zhì)粒純化系統(tǒng)購自美國Promega 公司;Bio-Tek多功能讀板機(jī)購自美國Bio-Tek Synergy HT公司，CKX41-32PH 型倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)購自日本Olympus 公司，BioImaging Systems購自美國UVP 公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):hESGc在KSFM 中按我科已經(jīng)建立的方法培養(yǎng)和鑒定[2]，取第1代細(xì)胞備用。

1.2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建:從GenBank中檢索到c-Met的cDNA序列(登錄號(hào):NM-000245)，按照siRNA設(shè)計(jì)的原則選取靶序列。正義鏈5'-AGGACAATGATGGCAAGAAATTTT-3'，反義鏈5'-ATTTCTTGCCATCATTGTCCTTTT--3'。參照He等[4-5]的方法先構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pSES-siRNA-c-Met，經(jīng)Pme I 酶切線性化后，與病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，再經(jīng)Pac I酶切純化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝出重組腺病毒，經(jīng)熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達(dá)，即為構(gòu)建成功，命名為AdR-siRNA c-Met，于HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增。取僅含有紅色熒光蛋白R(shí)FP的空病毒(Ad-RFP)做對(duì)照。

1.2.3 SiRNA met腺病毒轉(zhuǎn)染hESGc細(xì)胞:第1代的hESGc細(xì)胞接種于6孔板，KSFM培養(yǎng)，細(xì)胞的密度約60%～80%時(shí)，測定hESGc細(xì)胞的最適感染復(fù)數(shù)，每孔分別加入AdR-siRNA c-Met 0μl、2μl、4μl、8μl、16μl、48h后，在熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)表達(dá)RFP的細(xì)胞百分比(感染效率)，取感染效率80%以上，同時(shí)細(xì)胞沒有明顯由病毒本身引起的細(xì)胞毒現(xiàn)象的病毒量，最終確定為4μl AdR-siRNA c-Met病毒液/孔。同理對(duì)照組Ad-RFP合適的病毒量亦為4μl Ad-RFP病毒液/孔。由于培養(yǎng)hESGc細(xì)胞時(shí)，6孔板每孔中培養(yǎng)基約1ml，故適合用于轉(zhuǎn)染的病毒濃度為4μl病毒原液/ml培養(yǎng)基。

1.2.4 Westernblot檢測: 培養(yǎng)14h后，細(xì)胞用PBS洗兩遍后，加入新鮮的KSFM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48h，取細(xì)胞做westernblot檢驗(yàn)，明確AdR-siRNA c-Met的有效性。設(shè)置對(duì)照組(無影響因素)，陽性對(duì)照組(Ad-RFP轉(zhuǎn)染)和實(shí)驗(yàn)組(AdR-siRNA c-Met轉(zhuǎn)染)，在轉(zhuǎn)染后48h收集各組細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，超聲破碎細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白并采用BCA定量，取等量總蛋白(40μg)上樣，電泳，電轉(zhuǎn)， 5%脫脂牛奶封閉3h， 加一抗(兔抗c-Met多克隆抗體，小鼠抗β-actin 抗體)，室溫孵育2h，洗膜，加二抗(抗兔IgG-HRP，抗小鼠IgG-HRP)，室溫孵育1h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法檢測，曝光，顯影，定影，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Western blot 法測得所有數(shù)據(jù)均采用UVP BioImaging Systems 采集，將X 線片掃描后的圖像數(shù)據(jù)輸入LabWork 3.0 軟件進(jìn)行圖像分析，將內(nèi)參β-actin 作為標(biāo)準(zhǔn)積分吸光度(standard integral absorbance，SIA)，各目的條帶相對(duì)積分吸光度值(relativeintegral absorbance，RIA)=樣本積分吸光度值(integral absorbance，IA)/ SIA。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖: 實(shí)驗(yàn)分成4組，空白組，對(duì)照組，陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M不含細(xì)胞，僅于96孔板加入200μl KSFM，對(duì)照組，陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均于96孔板按 2×103個(gè)/孔接種hESGc，對(duì)照組每孔加入200μl KSFM，陽性對(duì)照組每孔加入含4μl /mL Ad-RFP 腺病毒的KSFM 200?l，實(shí)驗(yàn)組每孔加入含4μl /ml AdR-siRNA c-Met 的KSFM 200μl 。每一組每一時(shí)相點(diǎn)設(shè)六復(fù)孔。各組在0天，2天，4天時(shí)采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。從孵箱中取出待測96 孔板，每孔加入MTT 溶液(5g/L)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入DMSO 100μl，振蕩10min，在Bio-Tek 多功能讀板機(jī)570 nm 波長測定吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(陽性對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)組A 值)/ 陽性對(duì)照組A值×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK，P值<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SiRNA c-Met重組腺病毒轉(zhuǎn)染hESGc:所構(gòu)建的pSES-HUS-siRNA c-Met干擾序列由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心測序中心測序，包含目的基因在內(nèi)的序列正確。hESGc細(xì)胞轉(zhuǎn)染了AdR-siRNA c-Met后，熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白表達(dá)(見圖1)。

2.2 Westernblot檢測:hESGc細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdR-siRNA c-Met后48h，收集細(xì)胞進(jìn)行westernblot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AdR-siRNA c-Met轉(zhuǎn)染能抑制hESGc細(xì)胞中c-Met蛋白的表達(dá)(見圖2)，通過UVP BioImaging Systems 采集圖像后分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞中c-Met蛋白的抑制能達(dá)到70%以上。

2.3 MTT 法檢測細(xì)胞活力:在加入腺病毒轉(zhuǎn)染之前，各組間A 值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腺病毒轉(zhuǎn)染hESGc后，2天，4天均能抑制細(xì)胞的增殖，實(shí)驗(yàn)組A值與陽性對(duì)照組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑制率分別為16.8%(2天)和34.5%(4天)，但對(duì)照組與陽性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

HGF是一個(gè)多效應(yīng)生長因子，具有多種生物活性，參與機(jī)體多種器官組織細(xì)胞生長、再生和重塑，研究表明，HGF對(duì)多種細(xì)胞均有促進(jìn)增殖和運(yùn)動(dòng)的作用，如BMSCs、平滑肌細(xì)胞、牙髓細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞以及視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞等[6-8]。c-Met是HGF特異性受體，其在組織中廣泛存在，但是上皮細(xì)胞中表達(dá)濃度最高[9]。HGF與c-Met結(jié)合后，可誘導(dǎo)其發(fā)生構(gòu)像變化，激活受體胞內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的蛋白酪氨酸激酶(PTK) ，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化而激活受體[10]。除自身磷酸化外，c-Met 蛋白的酪氨酸激酶活性可導(dǎo)致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化，經(jīng)瀑布式磷酸化反應(yīng)，將信號(hào)逐級(jí)放大，最終轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化[11]。

汗腺起著排汗，調(diào)節(jié)體溫，物質(zhì)交換等重要作用，深入研究汗腺細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響因素，對(duì)揭示汗腺及其他管狀系統(tǒng)的發(fā)育和功能有著重要的意義，我們既往的研究表明[12]，hESGc上有HGF特異性受體c-Met表達(dá)，含40～80ng/ml的HGF的培養(yǎng)基能明顯促進(jìn)hESGc的增殖，20～40ng/ml HGF可促進(jìn)hESGc細(xì)胞移行(P<0.05)。下調(diào)c-Met對(duì)hESGc的生物學(xué)行為影響未見報(bào)道。

RNA干擾技術(shù)具有高效、穩(wěn)定且易操作等特點(diǎn)，Shinomiya等用腺病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)c-Met表達(dá)可抑制多種細(xì)胞的體外生長，器官發(fā)生和體內(nèi)成瘤[13]。本研究構(gòu)建了含siRNA c-Met的腺病毒，感染hESGc后能有效的抑制c-Met的表達(dá)，下調(diào)70%，能明顯抑制hESGc的增殖，2天抑制率為16.8% 4天抑制率為34.5%(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本實(shí)驗(yàn)通過基因轉(zhuǎn)染和RNA 干擾技術(shù)， 將針對(duì)c-Met 基因的靶向siRNA轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的hESGc，探討其對(duì)細(xì)胞c-Met的表達(dá)及細(xì)胞增殖能力的影響，為汗腺疾病的基因治療和汗腺發(fā)生發(fā)育研究提供新的思路和理論依據(jù)。

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[收稿日期]2010-06-20[修回日期]2010-08-18

編輯/張惠娟