翹嘴鱖NADPH氧化酶三個(gè)調(diào)節(jié)亞基cDNA的克隆及表達(dá)特征

胡寶慶，劉 毅，文春根,*

（1. 南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；2. 江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022）

翹嘴鱖NADPH氧化酶三個(gè)調(diào)節(jié)亞基cDNA的克隆及表達(dá)特征

胡寶慶1，劉 毅2，文春根1,*

（1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌330031；2.江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌330022）

吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS)，在機(jī)體的防御體系中起著非常重要的作用。該文利用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR的方法，對(duì)翹嘴鱖 (Siniperca chuatsi) NADPH氧化酶的3個(gè)調(diào)節(jié)亞基p40phox、p47phox和p67phox的cDNA進(jìn)行了克隆。結(jié)果顯示p40phox基因cDNA序列全長(zhǎng)為1 406 nt，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 050 nt，翻譯成349個(gè)氨基酸；p47phox 基因cDNA序列全長(zhǎng)為1 686 nt，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 209 nt，翻譯成402個(gè)氨基酸；p67phox基因cDNA序列全長(zhǎng)為2 185 nt，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 488 nt，翻譯成495個(gè)氨基酸。半定量PCR分析顯示在翹嘴鱖血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、腎、肝、脾、胸腺組織中都能檢測(cè)到這3個(gè)亞基的mRNA表達(dá)，然而，它們?cè)诓煌M織中的表達(dá)強(qiáng)度具有差異。經(jīng)柱狀黃桿菌滅活苗FKG4免疫后，p40phox亞基mRNA在翹嘴鱖血液和頭腎中的表達(dá)量顯著上升，p47phox在頭腎和脾臟中的表達(dá)量顯著上升，而p67phox在血液、頭腎和脾臟中的表達(dá)量均顯著上升。由此推斷NADPH氧化酶參與了翹嘴鱖機(jī)體的抗菌免疫應(yīng)答。

翹嘴鱖；NADPH氧化酶；分子克??；柱狀黃桿菌

NADPH氧化酶主要存在于中性粒細(xì)胞及其它吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上，能夠產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，具有殺菌作用，并參與宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答(Babior, 1999)。它由位于細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多種蛋白成分組成。細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶成分是異源二聚體跨膜蛋白，稱(chēng)為細(xì)胞色素b558，由gp91phox和p22phox兩個(gè)催化亞基組成(Nauseef, 2004)。細(xì)胞質(zhì)中的成分包括p40phox，p47phox，p67phox亞基及一個(gè)小分子量GTP結(jié)合蛋白R(shí)ac，這些亞基對(duì)于酶的活化起著調(diào)節(jié)作用，吞噬細(xì)胞受到細(xì)胞因子、激素或病原微生物刺激時(shí)，它們會(huì)裝配到細(xì)胞色素b558上，形成具有完整生物活性的多酶復(fù)合體(Nauseef, 2004)。人(Homo sapiens) (Rooyer-Pokora et al, 1986; Volpp et al, 1989; Leto et al, 1990; Wientjes et al, 1993)、鼠(Mus musculus) (Bjorgvinsdottir et al, 1996; Jackson et al, 1994; Mizuki et al, 1998)、野牛(Bison bison) (Gauss et al, 2002)和海豚(Tursiops truncatus) (Inoue et al, 2000, 2001)細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中NADPH氧化酶的5個(gè)亞基均已被克隆和描述。

除Rac外，魚(yú)類(lèi)NADPH氧化酶的5個(gè)亞基的cDNA也已從紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes) (Inoue et al, 2004)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)(Mayumi et al, 2008)中克隆。此外，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)的這5個(gè)亞基的cDNA全序列以及大西洋鮭(Salmo salar)的gp91phox、p47phox、p67phox亞基的cDNA全序列。

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)在我國(guó)分布廣泛，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，享有“淡水石斑”之譽(yù)。柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)是引起淡水魚(yú)類(lèi)爛鰓病發(fā)生的病原體。本文克隆了翹嘴鱖細(xì)胞質(zhì)中NADPH氧化酶的3個(gè)調(diào)節(jié)亞基基因cDNA全長(zhǎng)，并利用滅活柱狀黃桿菌菌苗（FKG4）對(duì)鱖魚(yú)進(jìn)行免疫，檢測(cè)這些亞基mRNA在鱖魚(yú)不同組織中的表達(dá)情況，以期為了解魚(yú)類(lèi)呼吸爆發(fā)的機(jī)制及柱狀黃桿菌疫苗的免疫途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物處理、FKG4的制備及免疫注射

翹嘴鱖購(gòu)自武漢市江夏區(qū)牛山湖漁場(chǎng)，為人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖，實(shí)驗(yàn)前，將購(gòu)得的魚(yú)（450±50）g在實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)充氣水循環(huán)系統(tǒng)中人工飼養(yǎng)14 d，水溫保持(25±1) °C，每日投喂小雜魚(yú)作為飼料，選取健康的魚(yú)作實(shí)驗(yàn)用。

取25 ℃振蕩培養(yǎng)36 h的柱狀黃桿菌培養(yǎng)液100 mL，10 000g離心10 min，沉淀用無(wú)菌PBS (pH7.2) 清洗3次，用含1.0%福爾馬林的PBS重懸，室溫下滅活24 h，10 000g離心10 min，PBS清洗兩次，離心，用無(wú)菌PBS稀釋到約1.0×108cell s/mL，置于4 °C冰箱備用。

免疫注射前，將FKG4菌苗取出升溫至室溫，實(shí)驗(yàn)魚(yú)用MS222溶液(1 mg/L)麻醉，分為2個(gè)組，每組6條，一組每尾魚(yú)經(jīng)胸鰭下注射0.1 mL的FKG4，另一組則每尾注射同等劑量的滅菌PBS作為對(duì)照組，然后繼續(xù)飼養(yǎng)7 d取樣。

1.2 主要試劑及菌株

Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，Ex-Taq聚合酶，DL-2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，PMD-18T載體、pTA2載體均購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mego公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。菌株F. columnare G4由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供，大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已報(bào)道的紅鰭東方豚和魟鱒的NADPH氧化酶p40phox、p47phox和p67phox亞基cDNA序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，特異性引物根據(jù)擴(kuò)增出來(lái)的中間片斷設(shè)計(jì)，所用引物均由上海華諾公司合成(表1)。

1.4 總RNA的提取和SMART cDNA的合成

分別取翹嘴鱖頭腎和脾臟混合，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)介紹的方法提取組織的總RNA。 瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit方法進(jìn)行第一鏈cDNA合成。具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 各亞基中間片段及全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增

根據(jù)表1所列引物，以第一鏈cDNA做為模板，先用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出基因的cDNA片段，再根據(jù)各個(gè)基因?qū)?yīng)的特異性引物，用5′-RACE引物和SMART 5′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′)擴(kuò)增基因的5′端，用3′-RACE引物和SMART 3′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT30VN-3′)擴(kuò)增基因的3′端。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序后，拼接基因的5′端和3′端序列，獲得各基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.6 基因的氨基酸推測(cè)和序列比較分析

將測(cè)序所得到的cDNA序列用NCBI網(wǎng)站(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN、BLASTX和TBLASTX軟件進(jìn)行同源基因的搜索，查找與其相關(guān)的同源序列；氨基酸序列的推斷和疏水性分析通過(guò)ExPASy網(wǎng)站上(http://www.expasy.org/)的軟件完成；氨基酸序列同源性比較由ClustalW1.8程序完成。 結(jié)構(gòu)域分析用SMART軟(http://smart.emblheidelberg.de)預(yù)測(cè)，按照MEGA 3.1中的鄰接法(neighbor-jointing method)構(gòu)建基于推導(dǎo)氨基酸的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，樹(shù)的可靠性以1 000次bootstrap重復(fù)來(lái)評(píng)判。

1.7 組織表達(dá)與實(shí)時(shí)熒光PCR

利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)翹嘴鱖NADPH氧化酶各調(diào)節(jié)亞基在魚(yú)體組織中的表達(dá)。提取健康魚(yú)血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、腎、肝、脾、胸腺組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將它們稀釋成相同的濃度，并以其為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物的電泳條帶的亮度強(qiáng)弱指示各亞基基因表達(dá)的高低。

用實(shí)時(shí)熒光PCR方法定量分析翹嘴鱖NADPH氧化酶各調(diào)節(jié)亞基在經(jīng)FKG4免疫注射后的魚(yú)體組織中表達(dá)變化。免疫注射FKG4后7 d提取免疫組和對(duì)照組翹嘴鱖血液、鰓、頭腎、腸及胸腺和脾臟中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Real-time PCR引物擴(kuò)增各基因序列（表1），PCR產(chǎn)物用DNA膠純化試劑盒純化后克隆進(jìn)入載體pTA2。質(zhì)粒DNA經(jīng)純化后用于制作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，曲線的斜率應(yīng)在?3.6與?3.2之間，相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.96。cDNA質(zhì)粒溶液的濃度以O(shè)D260光密度值下進(jìn)行測(cè)定，相應(yīng)的基因拷貝數(shù)按1 μg的1 000 bp DNA約等于9.1×109分子的公式進(jìn)行換算(Overbergh et al, 2003)。定量實(shí)時(shí)熒光PCR在Chromo4 Real-Time (MJ Research)上進(jìn)行；分別將翹嘴鱖NADPH氧化酶3個(gè)調(diào)節(jié)亞基在各組織中的基因拷貝數(shù)除以β-actin基因的拷貝數(shù)以得到均一化，所得比值用來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，免疫組和對(duì)照組之間特異基因表達(dá)的差異用t-檢驗(yàn)分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 翹嘴鱖NADPH氧化酶各調(diào)節(jié)亞基的cDNA全長(zhǎng)及特征

翹嘴鱖NADPH氧化酶3個(gè)調(diào)節(jié)亞基cDNA的全長(zhǎng)序列登錄號(hào)為DQ341372 (p40phox)、DQ341374 (p47phox)和DQ341373 (p67phox)。p40phox亞基cDNA序列全長(zhǎng)為1 406 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 050 bp，5′UTR長(zhǎng)度為138 bp，3′UTR長(zhǎng)度為218 bp包含mRNA不穩(wěn)定信號(hào)、加尾信號(hào)和poly(A)尾各1個(gè)。由cDNA序列推斷的蛋白包含349個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量為40.4 k，理論pI為6.50。p47phox亞基cDNA序列全長(zhǎng)為1 686 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 209 bp，5′UTR長(zhǎng)度為296 bp包含1個(gè)微衛(wèi)星序列(AC)，3′UTR長(zhǎng)度為181 bp包括mRNA不穩(wěn)定信號(hào)、加尾信號(hào)、 poly(A)尾各1個(gè)。該cDNA序列編碼402個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為46.2 k，理論pI為9.27。 p67phox亞基cDNA序列全長(zhǎng)為2 185 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 488 bp，5′UTR長(zhǎng)度為59 bp，3′UTR長(zhǎng)度為638 bp包括1個(gè)mRNA不穩(wěn)定信號(hào)、3個(gè)加尾信號(hào)和1個(gè)poly(A)尾。該cDNA序列翻譯成495個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分相對(duì)子質(zhì)量為55.4 k，理論pI為5.81。3個(gè)cDNA序列推斷的蛋白質(zhì)序列均無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。

2.2 翹嘴鱖與其他動(dòng)物的對(duì)應(yīng)調(diào)節(jié)亞基的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

用BLAST程序?qū)βN嘴鱖NADPH氧化酶3個(gè)調(diào)節(jié)亞基基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性搜索（表2）。翹嘴鱖NADPH氧化酶的3個(gè)亞基與紅鰭東方豚和虹鱒的同源亞基的氨基酸序列同源性在65.9%～82.5%之間，而與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動(dòng)物的對(duì)應(yīng)亞基同源性在44.2%～55.8%之間。

運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站的軟件分析各亞基的結(jié)構(gòu)與功能域發(fā)現(xiàn)， 翹嘴鱖的p40phox蛋白含有PX 結(jié)構(gòu)域(His18-Thr138)、SH3結(jié)構(gòu)域(Pro172-Lys227)、PB1(Leu246-Ala339)結(jié)構(gòu)域各1 個(gè)。P47phox蛋白序列包括PX結(jié)構(gòu)域(Asn4-Arg121)和SH3結(jié)構(gòu)域(Glu200-Gly255) 各1個(gè)。p67phox蛋白包括3個(gè)TPR基序(motif) (Ser37-Leu70；Ala71-Asn104；Cys121-Ala154)、1個(gè)PB1結(jié)構(gòu)域(Gln347-Lys425)和2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域(Glu243-Glu298；Ile436-Pro491)。另外，通過(guò)CLUSTAL比對(duì)顯示這些亞基的結(jié)構(gòu)域與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的亞基蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)基本上匹配(圖1—3)，說(shuō)明這些亞基的功能與哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的亞基相似。

表 2 由翹嘴鱖p40phox、p47phox和p67phox亞基的cDNA推斷的氨基酸序列與其他動(dòng)物對(duì)應(yīng)亞基氨基酸比較Tab. 2 Comparison of the amino acid homology among decuced amino acid sequences of p40phox, p47phox and p67phox subunit cDNA from Siniperca chuatsi and homologous genes from other species

圖 1 翹嘴鱖p40phox與其他脊椎動(dòng)物p40phox之間的氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Alignment of p40phox amino acid sequences of Siniperca chuatsi with that of other vertebrates

圖 2 翹嘴鱖p47phox 與其他脊椎動(dòng)物p47phox 之間的氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of p47phox amino acid sequences of Siniperca chuatsi with that of other vertebrates

對(duì)7種動(dòng)物NADPH氧化酶3個(gè)調(diào)節(jié)亞基建立NJ系統(tǒng)樹(shù)(圖4a, b, c)，結(jié)果顯示魚(yú)類(lèi)獨(dú)立于哺乳類(lèi)動(dòng)物之外，聚在同一枝上。翹嘴鱖NADPH氧化酶3個(gè)調(diào)節(jié)亞基在進(jìn)化上與紅鰭東方鲀的親緣關(guān)系最近。

2.3 翹嘴鱖p40phox、p47phox和p67phox亞基組織表達(dá)及免疫刺激后的基因表達(dá)

翹嘴鱖NADPH氧化酶3個(gè)調(diào)節(jié)亞基在魚(yú)體血液、腦、鰓、性腺、心臟、頭腎、腸、腎、肝、脾、胸腺組織中的基因表達(dá)強(qiáng)度不同(圖5)。在11種組織中都能檢測(cè)到各亞基的基因表達(dá)。p40phox在肝臟組織中表達(dá)最弱，在其他10種組織中表達(dá)都較強(qiáng)。p47phox在頭腎、鰓、心臟、脾組織中表達(dá)較強(qiáng)，在其余7種組織中的表達(dá)較弱；p67phox在頭腎、鰓、脾組織中表達(dá)較強(qiáng)，在血液、腦、性腺、心臟、腸、腎、胸腺組織中表達(dá)較弱，然而，在肝臟組織中幾乎檢測(cè)不到。

經(jīng)FKG4免疫后，翹嘴鱖3個(gè)調(diào)節(jié)亞基在血液、鰓、頭腎、腸、脾及胸腺組織中的表達(dá)也有差異(圖6)。在對(duì)照組鱖魚(yú)的頭腎中，3個(gè)亞基的表達(dá)量都很高。經(jīng)過(guò)免疫注射7d后，p40phox在鱖魚(yú)血液和頭腎組織中的表達(dá)顯著上升；p47phox在頭腎和脾組織中的表達(dá)顯著上升；p67phox在血液、頭腎和脾組織中的表達(dá)顯著上升；然而，3個(gè)調(diào)節(jié)亞基在鰓、腸及胸腺中的表達(dá)均無(wú)顯著地變化。

3 討 論

翹嘴鱖p40phox氨基酸序列長(zhǎng)度比紅鰭東方鲀p40phox長(zhǎng)1個(gè)氨基酸，比虹鱒p40phox短9個(gè)氨基酸，但比人、野牛、鼠、海豚等哺乳動(dòng)物p40phox長(zhǎng)10個(gè)氨基酸；p47phox的氨基酸序列長(zhǎng)度比紅鰭東方鲀p47phox短21個(gè)氨基酸，比虹鱒p47phox短9個(gè)氨基酸，比人、野牛、鼠和海豚等哺乳動(dòng)物p47phox分別長(zhǎng)12、10、12和11個(gè)氨基酸；p67phox的氨基酸序列長(zhǎng)度與紅鰭東方鲀p67phox相同，比虹鱒p67phox短9個(gè)氨基酸，比人、野牛、鼠、海豚等哺乳動(dòng)物p67phox分別短21、22、20、21個(gè)氨基酸。雖然翹嘴鱖NADPH氧化酶的3個(gè)調(diào)節(jié)亞基p40phox、p47phox和p67phox的氨基酸序列與人、鼠、野牛及海豚的相應(yīng)亞基長(zhǎng)度不一，且相似性較低，但是它們都有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和功能域以及相互作用位點(diǎn)。人的p40phox和p47phox的PX結(jié)構(gòu)能有選擇地識(shí)別PtdIns(3)P和PtdInsP2，這有助于它們?cè)诨罨蟊诲^定到細(xì)胞膜上，進(jìn)而裝配成有活性的多酶復(fù)合體，Arg57、Arg58、Tyr59、Arg105殘基對(duì)于維持這一功能是必要的(Nauseef, 2004; Karathanassis et al, 2002)。這一結(jié)構(gòu)在翹嘴鱖以及其它動(dòng)物內(nèi)都存在，并且這些位點(diǎn)均保守。人的p40phox的SH3結(jié)構(gòu)域能夠與p47phox的C端的PRR結(jié)構(gòu)相互作用，PC基序是與p67phox發(fā)生作用的部位 (Nauseef, 2004)。翹嘴鱖也像其他動(dòng)物一樣均具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。人的p67phox的TPR結(jié)構(gòu)與Rac亞基相互作用(Nauseef, 2004)，這一結(jié)構(gòu)在其他動(dòng)物中均存在。由此推斷翹嘴鱖與人的NADPH氧化酶亞基都擁有相似的活化機(jī)制。

哺乳動(dòng)物p67phox亞基的脯氨酸富裕區(qū)(PRR)是與亞基p47phox相互作用的重要區(qū)域(Wientjes et al, 2003)，而魚(yú)類(lèi)的該區(qū)域都不保守。由此推測(cè)在魚(yú)類(lèi)的p67phox亞基與p47phox亞基的相互作用可能比哺乳動(dòng)物弱。人的p47phox的PX結(jié)構(gòu)有兩個(gè)可區(qū)分的堿性區(qū)域，在空間結(jié)構(gòu)上呈兩個(gè)口袋狀，能識(shí)別磷脂酰肌醇，有助于p47phox在質(zhì)膜上的錨定；Arg43、Phe44和Arg90是第一個(gè)堿性袋必需的；Arg70、Lys55和 His51對(duì)第二個(gè)堿性袋的存在是必需的，兩個(gè)疏水性殘基Ile65與Trp80在結(jié)合時(shí)插入到質(zhì)膜或溶酶體膜上(Karathanassis et al, 2002; Stahelinet al, 2003)。雖然預(yù)測(cè)的翹嘴鱖p47phox蛋白的Ile65、Trp80殘基和Arg70、Lys55、His51很保守，但是Arg43、Phe44殘基分別被Thr 和Tyr殘基替代。因此，推測(cè)翹嘴鱖p47phox的PX結(jié)構(gòu)的第一個(gè)堿性袋可能不存在，表明p47phox結(jié)合到質(zhì)膜或溶酶體膜上的能力比哺乳動(dòng)物要弱。過(guò)去認(rèn)為p47phox N端PX結(jié)構(gòu)域中的PXXP結(jié)構(gòu)域起著自動(dòng)抑制的作用，它能與p47phox C端的SH3區(qū)域相互作用，掩蓋了磷脂酰肌醇結(jié)合位點(diǎn)，因而阻止了細(xì)胞質(zhì)亞基復(fù)合物與膜的結(jié)合(Hiroaki et al, 2001)。最近資料認(rèn)為p47phox的兩個(gè)SH3結(jié)構(gòu)能形成一個(gè)小溝，p47phox的堿性區(qū)域被掩蓋在這個(gè)小溝內(nèi)，在細(xì)胞靜息期，小溝中保守的Trp193和Trp263殘基與堿性區(qū)域的核心結(jié)構(gòu)(296～304殘基)相互作用，從而起到自動(dòng)抑制作用，這2個(gè)SH3對(duì)于維持這種作用都是必需的(Groemping & Rittinger, 2005)。紅鰭東方鲀、虹鱒的p47phox像其他動(dòng)物一樣，都包含2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域 (Inoue et al, 2004)，但是翹嘴鱖p47phox僅有1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)，而且Trp193殘基缺失，因此推測(cè)翹嘴鱖堿性區(qū)域與SH3結(jié)構(gòu)域之間的相互作用可能不存在或很弱，它的分子間自動(dòng)抑制作用可能是由PXXP與SH3區(qū)域相互作用造成。

圖 3 翹嘴鱖p67phox與其它脊椎動(dòng)物p67phox之間的氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Alignment of p67phox amino acid sequences of Siniperca chuatsi with that of other vertebrates

圖 4 用7種動(dòng)物p40phox(a)、p47phox(b)、p67phox(c)亞基氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree inferred from amino acid sequences of subunits of p40phox(a)，p47phox(b)，p67phox(c) from seven animals

圖 5 翹嘴鱖p40phox, p47phox, p67phox亞基在不同組織中的基因表達(dá)Fig. 5 Expression of Siniperca chuatsi p40phox, p47phox, p67phox transcripts in a variety of tissues

圖 6 翹嘴鱖p40phox (a)、p47phox (b)及p67phox (c)在免疫魚(yú)(■)與對(duì)照魚(yú)(□ ) 6種織中的表達(dá)Fig. 6 Expression of Siniperca chuatsi p40phox (a), p47phox (b) and p67phox (c) in 6 tissues of vaccinated (■) and control fish (□)

磷酸化作用被認(rèn)為是NADPH氧化酶活化過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵的事件。大多數(shù)的亞基(除Rac和gp91phox)在活化過(guò)程中都顯示不同程度的磷酸化，人的p47phox有11處磷酸化位點(diǎn)，分別位于絲氨酸303、304、310、315、320、328、345、348、359、370和379（Groemping & Rittinger, 2005)。p40phox有2處磷酸化位點(diǎn)，位于Thr154 和Ser315(Groemping & Rittinger, 2005)，p67phox僅確定Thr233發(fā)生磷酸化(Groemping & Rittinger, 2005)。翹嘴鱖的這些亞基絕大多數(shù)磷酸化位點(diǎn)都很保守，然而，p40phox的Gly321代替了相應(yīng)位點(diǎn)的Ser315；p47phox的Ser345、Ser359分別被Ala、Lys代替；p67phox中Thr233被Glu233取代，由此表明翹嘴鱖NADPH氧化酶3個(gè)亞基的磷酸化作用比哺乳動(dòng)物弱。

魚(yú)類(lèi)脾臟的橢圓體、頭腎中的造血組織、心臟的圍心腔及血液等組織中含有較為豐富的吞噬細(xì)胞(Ellis, et al, 1976)。鰓、腸作為魚(yú)類(lèi)主要的黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue)，也含有較為豐富的吞噬細(xì)胞 (McMillan et al, 1997; Lin et al, 1998)。這些吞噬細(xì)胞都能夠產(chǎn)生呼吸爆發(fā)(respiratory burst) (Lin et al, 1999; Clerton et al, 1998)。因此，翹嘴鱖的3個(gè)亞基的mRNA在頭腎、脾臟、血液中表達(dá)量較高，這與鯽魚(yú)和紅鰭東方鲀的表達(dá)模式是一致的(Inoue et al, 2004; Mayumi et al, 2008)。即使在同一組織中，三個(gè)亞基的mRNA表達(dá)量也有些差異，可能是由于各亞基基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)間差異造成的。利用LPS體外刺激人或紅鰭東方鲀的粒細(xì)胞6～24 h后，NADPH氧化酶的各亞基中，均只有p47phox的mRNA表達(dá)顯著上升，其他亞基的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(Inoue et al, 2004; Cassatella et al, 1991)。然而，用FKG4對(duì)翹嘴鱖進(jìn)行免疫刺激后發(fā)現(xiàn)，不僅p47phox在頭腎、脾中的表達(dá)顯著上升，而且p40phox和p67phox在頭腎、脾和血液中的表達(dá)也顯著上升。這可能是由于活體免疫刺激了魚(yú)體的這些主要免疫器官，從而導(dǎo)致組織中粒細(xì)胞含量增多；在鰓、腸、胸腺中的表達(dá)變化不顯著，可能是由于這些組織在魚(yú)體免疫系統(tǒng)中處于次要地位。

致謝：本研究得到了中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所聶品實(shí)驗(yàn)室的幫助，在此表示感謝！

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cDNA Cloning and Expression Characterization of Three Regulatory Subunits of NADPH Oxidase Within Cytoplasm from Mandarin Fish,Siniperca chuatsi

HU Bao-Qing1, LIU Yi2, WEN Chun-Gen1,*

(1. College of Life Sciences, Nanchang University, Nanchang 330031, China;
2. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

The phagocyte NADPH oxidase plays a crucial role in host defense against invading microorganisms by catalyzing the formation of reactive oxygen species, which is the precursor of a variety of microbicidal oxidants such as hydrogen peroxide (H2O2). In the present study, full-length cDNAs of three regulatory subunits of NADPH oxidase, including p40phox, p47phox, p67phox were cloned from head kidney of mandarin fish utilizing the reverse transcription polymerase chain reaction and rapid amplification of cDNA ends. Sequence analysis showed that the full length cDNA of p40phox is 1 406 nt, containing a 1 050 nt open reading frames that encodes a 349 amino acid protein, the full length cDNA of p47phox is 1 686 nt, containing a 1 209 nt open reading frames that encodes a 402 amino acid protein, the full length cDNA of p40phox is 2 185 nt, containing a 1 488 nt open reading frames that encodes a 495 amino acid protein. Semi-quantitative RT-PCR analyses from various tissues indicated that mRNAs of the three subunits can be detected in the blood, brain, heart, spleen, kidney and thymus, but their expression intensity are different in tissues. Stimulating the mandarin fish with formalin killedFlavobacterium columnareG4 significantly up-regulated the expression of p40phox in blood and head kidney; and p47phox in head kidney and spleen; and p67phox in blood, head kidney and spleen. The results suggested that mandarin NADPH oxidase was involved in the immune responses against bacteria.

Siniperca chuatsi; NADPH oxidase; Molecular cloning;Flavobacterium columnare

胡寶慶（1972-），男，江西波陽(yáng)人，講師，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物疾病研究。E-mail：baoqinghu@sina.com

Q78; Q959.483； Q959.483.06

A

0254-5853-(2010)03-0250-11

10.3724/SP.J.1141.2010.03250

2009-09-14；接受日期：2009-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30960296)；江西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2004）

*通訊作者(Corresponding author)，文春根 （1963?），男，漢族，江西南昌人，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物疾病方面的研究。E-mail: cgwen@ncu.edu.cn