鎘對中國林蛙變態(tài)和性腺分化的影響

黃敏毅，王宏元，張育輝*

（1. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2. 安慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶 246011）

鎘對中國林蛙變態(tài)和性腺分化的影響

黃敏毅1,2，王宏元1，張育輝1,*

（1. 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2. 安慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶 246011）

將發(fā)育到26—27期的中國林蛙（Rana chensinensis）共200例蝌蚪分別暴露在0.05、0.1、0.2和0.4 mg/L Cd2+的水體中直至完全變態(tài)。解剖完全變態(tài)后的幼蛙，觀察其性腺分辨性別，統(tǒng)計雌性比率。用免疫組織化學(xué)方法檢測雌激素受體（estrogen receptors，ER）在肝細(xì)胞的表達定位。結(jié)果顯示：①Cd2+誘導(dǎo)蝌蚪變態(tài)時出現(xiàn)肢體畸形，但畸形率與Cd2+處理濃度相關(guān)性較低，0.4 mg/L Cd2+組肢體畸形率較高。②Cd2+影響林蛙幼體的性腺分化。與對照組相比，0.05 mg/L Cd2+組的雌性比率明顯增大，0.1、0.2和0.4 mg/L Cd2+組的雌性比率相對降低，其中0.2 mg/L Cd2+組差異顯著。在0.2和0.4 mg/L Cd2+組中出現(xiàn)個別雌雄同體。 ③ER在Cd2+處理組的肝細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有陽性表達，但ER的表達量與Cd2+濃度不呈現(xiàn)線性相關(guān)。以上結(jié)果表明，Cd2+可以通過干擾性激素的分泌而影響蝌蚪變態(tài)和性腺發(fā)育。

鎘；中國林蛙；肢體畸形；性腺

重金屬鎘是動物體內(nèi)的非必需元素，具有致癌、致畸和致突變的毒性，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有激素效應(yīng)，對生殖和內(nèi)分泌功能具有較大的影響，但對其研究，大部分集中在哺乳動物（Byrne et al，2009；Iavicoli et al，2009）。據(jù)報道，兩棲動物種群數(shù)量在急劇下降，環(huán)境化學(xué)污染是其重要的影響因素之一（Alford et al，2001；Hayes et al，2002；Kiesecker et al，2001）。有報道證明，許多外源性化學(xué)物質(zhì)具有類雌激素作用，導(dǎo)致兩棲動物性腺發(fā)育異常（B?gi et al，2003；Carey & Bryant，1995；Hayes et al，2003）。鎘對于兩棲動物的有關(guān)毒性研究大都集中在對其生長發(fā)育的影響（Gross et al，2007；Sharma & Pati?o，2008），而對生殖活動的激素效應(yīng)研究較少（Sharma & Pati?o，2009）。中國林蛙（Rana chensinensis）是一種具有經(jīng)濟價值的兩棲動物，廣泛分布于中國北方各地。鎘對于林蛙蝌蚪的急性毒性以及對生長發(fā)育影響的有關(guān)實驗證實，鎘對蝌蚪的安全濃度為1.22 mg/L Cd2+。在安全濃度以下，鎘可抑制中國林蛙蝌蚪的生長發(fā)育，延緩變態(tài)（Huang & Zhang，2006）。本文就鎘對于蝌蚪變態(tài)過程中的慢性毒性以及對性腺分化和性別決定的效應(yīng)著重報道，以期探討低濃度鎘對于兩棲動物幼體產(chǎn)生異常發(fā)育以及對生殖內(nèi)分泌活動的影響，為中國林蛙生殖生態(tài)研究提供參考資料，并為環(huán)境保護和治理提供評價指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用試劑氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），相對分子質(zhì)量228.35，AR，純度99%（西安化學(xué)試劑廠產(chǎn)品）。中國林蛙受精卵采于秦嶺北坡的溝麓地帶，室內(nèi)孵化，蝌蚪發(fā)育到26—27期，適應(yīng)2 d后，選取體質(zhì)健康、大小相似的個體進行實驗。

1.2 暴露實驗樣本處理

在Cd2+的安全濃度下（Huang & Zhang，2006），分別設(shè)濃度為0.05、0.1、0.2和0.4 mg/L Cd2+4個處理組和1個對照組。將蝌蚪暴露在35 cm×27 cm×12 cm水族箱含Cd2+的水體中，每組40例，共200例。用4 L曝氣3 d以上的自來水，水溫15—21℃。到尾退化后期，停止加Cd2+，改用500 mL水體；變態(tài)期在水族箱一角放入沙土，以便幼蛙活動。每2 d換1次水，同時加藥，禁食0.5 d。所加食物有蛋黃、豆渣和菜葉，用AA-320型原子吸收分光光度計檢測食物，未檢測到Cd2+含量。

實驗中觀察出現(xiàn)畸形的蝌蚪及幼蛙行為，在蝌蚪完成變態(tài)后，統(tǒng)計幼蛙畸形率；剔除畸形個體肢體肌肉，用Leica體視顯微鏡觀察畸形肢體的骨骼，Sony數(shù)碼相機拍照。

用體視顯微鏡觀察完全變態(tài)后幼蛙的性腺，統(tǒng)計雌性比率。部分不易分辨的性腺做常規(guī)石蠟切片，HE染色后，在顯微鏡下觀察分辨。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

從各組幼蛙中隨機選取10例雄性個體，麻醉后剖腹， 摘取肝臟。 取材后置改良的Bouin’s液固定，常規(guī)石蠟切片，片厚5 μm。片經(jīng)裱后烘干。

采用SABC免疫組織化學(xué)程序：（1）切片常規(guī)脫蠟至水。（2）將切片浸入用蒸餾水配置的3% H2O2，室溫下處理5—10 min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗3次。（3）用0.01 M/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH＝6.0）熱修復(fù)2—3次，即加熱至沸騰（92—95℃），間隔10 min，PBS洗1—2次。（4）抗原修復(fù)液修復(fù)5—10 min，PBS洗3次。（5）山羊血清室溫下封閉30 min。（6）甩去血清，滴加第一抗體稀釋液，分別為兔抗人雌激素受體（ER）（1∶100，Boster產(chǎn)品）。4℃孵育24 h，PBS洗2 min×3次。（7）滴加即用型羊抗兔IgG (Boster產(chǎn)品)，20—37℃孵育30 min，PBS洗2 min×3次。（8）滴加SABC復(fù)合物，20—37℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS洗5 min×4次。（9）DAB顯色5—30 min，用0.1 mol/L PBS沖洗以終止反應(yīng)。（10）常規(guī)脫水，透明，封片。（11）鏡檢，拍照。用PBS代替一抗作陰性對照。

鏡檢陽性反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)和胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，顆粒染色明顯高于背景底色為陽性，陰性對照為無色。

1.4 圖像分析處理

從各組隨機選3張切片，用Leica DMLB2顯微鏡在每張切片上選5個視野，通過圖像采集系統(tǒng)（Leica Qwin V3）采集圖像，在同一條件下，每個視野內(nèi)測定10個細(xì)胞的免疫陽性反應(yīng)物灰度，灰度水平分0—256級，代表ER表達的相對值。陽性反應(yīng)越強著色越深，其相對值越小。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，總體比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用事件后分析（post-hoc，LSD）檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 鎘對于林蛙肢體發(fā)育的影響

統(tǒng)計鎘處理后的幼蛙畸形率，結(jié)果在0.05、0.1、0.2和0.4 mg/L Cd2+組，幼蛙的畸形率分別為10%、5%、1%和18%（表1）。不同鎘濃度處理組蝌蚪在不同發(fā)育時期的畸形各異，每個處理組均有部分蝌蚪的尾部出現(xiàn)彎曲變形（圖1:1），而對照組則沒有。在變態(tài)后，與對照組里正常的幼蛙（圖1：2）不同，處理組一些幼蛙出現(xiàn)前后肢畸形，在0.05 mg/L Cd2+組出現(xiàn)兩后肢交叉彎曲（圖1：3）；0.4 mg/L Cd2+組的畸形有的后肢一側(cè)伸直，另一側(cè)正常（圖1：4），有的則雙側(cè)后肢均伸直（圖1：5）；有的兩側(cè)后肢不對稱，出現(xiàn)傾斜（圖1：6）；在0.1 mg/L Cd2+組幼蛙的畸形為兩側(cè)后肢柔弱，在蹠骨和跗骨關(guān)節(jié)處出現(xiàn)彎曲（圖1：7）；在0.2 mg/L Cd2+組個別畸形表現(xiàn)為右前肢向左彎曲（圖1：8）。

剝離正常幼蛙后肢，游離后肢骨：股骨、脛腓骨、跗骨、蹠骨和趾骨等5部分，股骨為一長骨，近端的股骨頭膨大成球形，入髖臼構(gòu)成髖關(guān)節(jié)，遠(yuǎn)端與脛腓骨相關(guān)節(jié)，兩端均有軟骨（圖1：9）。脛腓骨由脛、腓兩骨合并而成，脛骨較粗，腓骨較細(xì)，近端與股骨形成膝關(guān)節(jié)，遠(yuǎn)端與跗骨形成踝關(guān)節(jié)（圖1：10）。在畸形幼蛙的后肢，股骨和脛腓骨之間無正常關(guān)節(jié)之間的凹凸相接，缺少關(guān)節(jié)腔（圖1：11，12，13）。蹠骨和附骨之間的關(guān)節(jié)出現(xiàn)彎曲（圖1：14，15）。

2.2 畸形個體的運動行為

畸形蝌蚪或幼蛙運動緩慢，對外界刺激反應(yīng)遲鈍?；沃w致使其跳躍運動障礙，一般多在淺水中靜息，在外加刺激時才有所反應(yīng)，一般刺激1次，可連續(xù)跳躍1—3次，而后休息。在對照組，正常的幼蛙，刺激1次會連續(xù)跳躍5—7次，尋找躲避位置。在兩側(cè)后肢均伸直的個體，其運動則依賴前肢匍匐拖動身體；在一側(cè)后肢伸直另一側(cè)正常的個體，依賴于正常后肢的彎曲做跳躍運動；在一側(cè)前肢畸形的個體，依靠另一側(cè)前肢與后肢跳躍，運動時身體常偏向畸形前肢的一側(cè)。

2.3 鎘對于林蛙雌性比率的影響

在完成變態(tài)后的正常幼蛙，雄性的精巢呈長棒狀，乳白色，表面光滑，大小均勻，較卵巢小。組織切片觀察，精巢內(nèi)生精小管分化不明顯，主要是精原細(xì)胞。雌性幼蛙卵巢呈扁平條狀，乳白色，含半透明狀顆粒。顯微鏡下觀察，卵巢內(nèi)有圓形、橢圓形的卵母細(xì)胞。

統(tǒng)計變態(tài)后幼蛙的雌性比率，對照組雌性為57.5%。與對照組相比，0.05 mg/L Cd2+組雌性比率顯著增大（P＜0.05，one-way ANOVA）；0.1 mg/L Cd2+組差異不顯著（P＞0.05，one-way ANOVA）；0.2 mg/L Cd2+組的雌性比率較低（P＜0.05）；0.4 mg/L Cd2+組差異不顯著（P＞0.05，one-way ANOVA）（表1）。在0.2和0.4 mg/L Cd2+處理組，出現(xiàn)個別雌雄同體，即一側(cè)為精巢，另一側(cè)為卵巢；還有的出現(xiàn)精卵巢現(xiàn)象（圖2）。

表 1 鎘的處理后林蛙的畸形率和雌性比率Tab. 1 Malformed rate and female rate of young frog R. chensinensis treated with cadmium

2.4 鎘處理后幼蛙肝細(xì)胞中的ER表達

在對照和鎘處理組雄性幼蛙的肝細(xì)胞中，ER在胞質(zhì)和胞核均有陽性反應(yīng)，著色由淺黃至棕黃色，陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈顆粒狀聚集，陰性對照無陽性反應(yīng)。通過對陽性反應(yīng)產(chǎn)物的檢測，分析其表達相對值，雖然在鎘的處理組幼蛙的肝細(xì)胞內(nèi)ER均有表達，但其表達的強弱與處理濃度之間并不呈現(xiàn)規(guī)律性關(guān)系（圖3）。與對照組比較，0.05 mg/L Cd2+組 ER呈強陽性反應(yīng)（P＜0.05，one-way ANOVA）；0.1和0.2 mg/L Cd2+組ER呈現(xiàn)弱陽性反應(yīng)（P＜0.05，one-way ANOVA）；0.4 mg/L Cd2+組與對照組無明顯差異（P＞0.05，one-way ANOVA）。

3 討 論

3.1 鎘對于林蛙蝌蚪變態(tài)的影響

圖 2 中國林蛙雌雄同體性腺Fig. 2 Hermaphrodite gonads in R. chensinensis

圖 3 雄性幼蛙肝細(xì)胞ER表達的相對值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Fig. 3 Relative value of ER in liver cells of male young frog R. chensinensis (Mean±SD)

實驗表明，鎘是可以影響中國林蛙蝌蚪的生長發(fā)育，延緩發(fā)育。隨著鎘濃度的升高，蝌蚪完成變態(tài)的速度降低，變態(tài)所需的時間延長（Huang & Zhang，2006）。本實驗結(jié)果可見，蝌蚪在發(fā)育變態(tài)為幼蛙的過程中，低濃度鎘的處理后，幼蛙肢體出現(xiàn)畸形，但畸形率與鎘濃度未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。目前已經(jīng)知道，兩棲動物的肢體發(fā)育是一個可塑性過程，許多環(huán)境因子都可能干擾肢體的發(fā)育程序，產(chǎn)生肢體畸形（Ankley et al，2004）。本實驗中幼蛙肢體畸形僅出現(xiàn)鎘處理組，對照組則沒有，說明影響肢體發(fā)育造成畸形的主要是鎘的干擾。但是肢體的畸形率并沒有與濃度呈現(xiàn)相一致的關(guān)系，這可能與機體內(nèi)存在的金屬硫蛋白有關(guān)。一定濃度的鎘離子可誘導(dǎo)金屬硫蛋白快速表達，金屬硫蛋白與鎘離子的高度親和后又可以降低鎘的毒性（Klaassen et al，2009）。由于鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬硫蛋白是一個復(fù)雜過程，不同個體的反應(yīng)能力可能存在差異，故畸形的發(fā)生率不一定與鎘對林蛙的處理濃度相吻合，詳細(xì)機制仍有待揭示。

兩棲動物的變態(tài)依賴于體內(nèi)甲狀腺素的水平，甲狀腺素對機體的新陳代謝、神經(jīng)組織和骨的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用，垂體?甲狀腺軸可作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物活動作用的靶目標(biāo)（Gray et al，2002）。鎘離子可通過影響甲狀腺的活動，影響蝌蚪的變態(tài)（Sharma & Pati?o，2008）。本實驗結(jié)果可見，在蝌蚪變態(tài)過程中，鎘可導(dǎo)致蝌蚪動作遲緩，尾部出現(xiàn)彎曲變形，肢體畸形。這些是否為鎘離子通過干擾甲狀腺活動所致，仍需實驗證實。

3.2 鎘對于林蛙蝌蚪性別分化的影響

兩棲動物大多數(shù)物種的性腺分化不受基因決定，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可通過影響性類固醇激素的活動而干擾性腺分化（Hayes, 1998）。Sharma & Pati?o（2009）用濃度分別為1、8和85 μg/L Cd2+處理非洲爪蟾的胚胎直至變態(tài)，結(jié)果表明，鎘可影響其生長發(fā)育，沒有影響性別分化，可見鎘對于非洲爪蟾未表現(xiàn)出強的激素效應(yīng)，但該研究認(rèn)為此結(jié)果不排除鎘對于兩棲動物具有弱的激素效應(yīng)。中國林蛙的性腺分化從31期開始，37期完成卵巢分化，精巢分化在變態(tài)后完成，性腺分化對外界環(huán)境敏感（Li et al，2001）。本實驗的鎘暴露處理在蝌蚪26—27期至完全變態(tài)，處理過程歷經(jīng)性腺分化時期。實驗結(jié)果表明，鎘對于林蛙蝌蚪性腺分化有影響，具有一定的激素效應(yīng)，但這種效應(yīng)并不與鎘的劑量呈現(xiàn)線性相關(guān)。這個結(jié)果與鎘對非洲爪蟾性腺分化的影響存在差異，是由于物種的差異還是由于處理濃度和處理方式的不同，原因仍不明了。

Carey & Bryant（1995）報道，亞致死量的化學(xué)物質(zhì)可使兩棲動物的變態(tài)滯后，出現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象。Hayes et al（2003）在實驗室內(nèi)用阿特拉津誘導(dǎo)美洲豹蛙幼體出現(xiàn)雌雄同體，推測這種除草劑可能通過提高芳香化酶的合成，使幼體出現(xiàn)雌雄同體。含有烷基酚等具有雌激素活性的水體也可導(dǎo)致非洲爪蟾和歐洲林蛙會產(chǎn)生鑲嵌型的性腺（B?gi et al，2003）。本實驗的0.2和0.4 mg/L Cd2+處理組中，有個別雌雄同體。一般認(rèn)為，環(huán)境化學(xué)污染物對性腺分化的影響是對類固醇激素合成的關(guān)鍵蛋白StAR分子或一些關(guān)鍵酶的影響，導(dǎo)致類固醇激素合成受阻，從而出現(xiàn)雌雄同體（Walsh et al，2000）。

3.3 鎘對雄性個體肝細(xì)胞內(nèi)ER表達的影響

雌激素對靶細(xì)胞的作用由雌激素受體（ER）介導(dǎo)，ER作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因表達。雌激素主要在肝細(xì)胞中代謝和分解，肝細(xì)胞內(nèi)存在ER，分布在肝細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（Chamness et al，1975）。所以，肝對血液中雌激素水平較敏感（Vogiatzis & Loumbourdis，1998）。因此，通過檢測肝細(xì)胞內(nèi)ER的變化，可對內(nèi)分泌干擾物的激素效應(yīng)進行有效地評估（Lutz & Kloas，1999）。用17β–雌二醇（E2）處理雄性大鼠，肝內(nèi)ER和ER mRNA水平提高（Koritnik et al，1995），說明E2可高調(diào)肝細(xì)胞ER水平，而ER的高調(diào)則可能與雄性個體雌性化有關(guān)（Villa et al，1988）。

鎘屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，鎘的激素效應(yīng)已有報道，但在不同條件下，鎘是雌激素效應(yīng)還是雄激素效應(yīng)占主導(dǎo)地位尚無確切定論，且在同一物種中，鎘誘導(dǎo)的激素效應(yīng)依賴于鎘的劑量（Byrne et al，2009；Iavicoli et al，2009）。在本實驗，較低濃度組的ER表達高調(diào)，較高濃度組的ER表達降低，而最高濃度組的ER表達卻變化不明顯。這可能與鎘離子通過與ER相互作用抑制正常激素與ER的結(jié)合相關(guān)（Stoica et al，2000；Martin et al，2003）。所以雖然肝細(xì)胞ER表達水平的變化與鎘對于林蛙劑量有關(guān)，但這種關(guān)系與在肢體畸形發(fā)生以及性腺分化中的效應(yīng)類似，同樣不是一種線性相關(guān)，這可能是激素效應(yīng)的特性。

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Effects of Cadmium on Metamorphism and Gonad Differentiation inRana chensinensis

HUANG Min-Yi1,2, WANG Hong-Yuan1, ZHANG Yu-Hui1,*

（1.College of Life Science, Shaanxi Normal University,Xi’an710062, China; 2.School of Life Science, Anqing Teachers College, Anqing246011,China）

200 tadpoles ofRana chensinensisat stage 26 ? 27 were exposed to 0.05, 0.1, 0.2 or 0.4 mg/L Cd2+in tap water respectively until they’re fully metamorphic after which the heteromorphic young frogs in different treatments were anatomized, females and males were identified through gonad observation, and the female ratio was calculated. Localization of estrogen receptors (ER) in liver cells was investigated in different treatments using immunocytochemistry. The results showed that Cd2+might induce limb abnormality, however, there was little correlation between abnormality rate and cadmium concentration in lower Cd2+levels except for a higher limb abnormality ratio in the 0.4 mg/L group. On the other hand, Cd2+could affect gonad differentiation. Compared to the control group, the proportion of female population increased in the 0.05 mg/L group and decreased in the 0.1, 0.2 and 0.4 mg/L ones. The sex rate in the 0.2 mg/L group is significantly different from that in the control group. Hermaphrodite gonads appeared in the two treatments with 0.2 mg/L and 0.4 mg/L of Cd2+. Additionally, ER expression was positive in both cytoplasm and nucleolus of liver cells in Cd2+treated groups. But, there was no linear relationship between ER expressions levels and the concentration of Cd2+. These results suggested that cadmium can influence tadpole metamorphosis and gonad development by affecting the secretion of sex hormone.

Cadmium;Rana chensinensis; Limb abnormality; Gonad

X174：Q959.530.5；O614.242 ; Q954.5

A

0254-5853-(2010)03-0275-07

10.3724/SP.J.1141.2010.03275

2009-09-17；接受日期：2010-01-09

國家自然科學(xué)基金資助項目（(130770243）

*通訊作者（Corresponding author），E-mail: yu-huizhang@163.com

黃敏毅，女，碩士研究生，主要從事動物生態(tài)毒理學(xué)研究