芬太尼類(lèi)化合物與阿片μ受體相互作用的分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬

李 博 劉 明 胡文祥,*

(1首都師范大學(xué)物理有機(jī)與藥物化學(xué)研究所,北京 100048;2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048)

芬太尼類(lèi)化合物與阿片μ受體相互作用的分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬

李 博1劉 明2胡文祥1,*

(1首都師范大學(xué)物理有機(jī)與藥物化學(xué)研究所,北京 100048;2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048)

采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬方法研究了芬太尼類(lèi)化合物與阿片μ受體的相互作用機(jī)制.先用AutoDock4.0程序?qū)⒎姨犷?lèi)化合物對(duì)接到同源模建的阿片μ受體結(jié)構(gòu)中,再用GROMACS程序包在水溶液體系中分別對(duì)12個(gè)芬太尼激動(dòng)劑和阿片μ受體蛋白復(fù)合物進(jìn)行了MD模擬研究,優(yōu)化對(duì)接復(fù)合物的結(jié)構(gòu),最后利用MM-PBSA方法,在APBS程序中計(jì)算芬太尼類(lèi)衍生物與阿片μ受體的結(jié)合自由能,計(jì)算出的受體配合物結(jié)合常數(shù)(Ki)與其實(shí)驗(yàn)值吻合較好,并預(yù)測(cè)了化合物的活性排序.結(jié)果表明,復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)與空載受體蛋白結(jié)構(gòu)有較大差異,特別是胞內(nèi)區(qū)IL2、IL3和跨膜區(qū)段TM4骨架構(gòu)象變化較大,不同的化合物對(duì)受體結(jié)構(gòu)影響也有差異,活性較好的化合物會(huì)增加蛋白特定區(qū)域結(jié)構(gòu)的柔性.芬太尼類(lèi)化合物可能是通過(guò)和受體結(jié)合后誘導(dǎo)阿片μ受體構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詷?gòu)象,引起一系列的信號(hào)傳導(dǎo)激活G蛋白,從而引發(fā)生理效應(yīng).

分子動(dòng)力學(xué);芬太尼;阿片μ受體;分子對(duì)接

阿片μ受體是阿片受體μ、κ、δ三種重要亞型之一[1],目前這三種阿片受體的基因均已被克隆[2],研究發(fā)現(xiàn)阿片類(lèi)選擇性激動(dòng)劑激動(dòng)脊上和脊髓μ受體能引起一系列生理效應(yīng)[3],具體表現(xiàn)為止痛效應(yīng)、犒賞效應(yīng)、心率減慢、呼吸抑制、腸蠕動(dòng)抑制、僵住癥和成癮性等[4].嗎啡為經(jīng)典的阿片μ受體激動(dòng)劑,納洛酮為其拮抗劑[5].阿片μ受體屬G蛋白偶聯(lián)受體(G protein couple receptor,GPCR),GPCR具有相同的基本結(jié)構(gòu),即有一個(gè)細(xì)胞外氨基端區(qū)域,七個(gè)跨膜域以及一個(gè)細(xì)胞內(nèi)羥基端尾區(qū)[6].

芬太尼(fentanyl)學(xué)名為1-苯乙基-4-(N-丙酰苯胺)哌啶,為阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥,它的鎮(zhèn)痛效力約為嗎啡的100-180倍，哌替啶的550-1000倍[7],并具有毒性低、對(duì)循環(huán)影響小、時(shí)效短(15-30 min)、容易控制、術(shù)后自主呼吸恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn),故近年來(lái)越來(lái)越受到人們的重視.芬太尼、舒芬太尼和阿芬太尼等芬太尼類(lèi)配體藥效增強(qiáng)、起效迅速、作用消失快,靜脈滴注容易控制止痛劑量、安全可靠[8].關(guān)于芬太尼類(lèi)激動(dòng)劑與阿片μ受體選擇性結(jié)合的分子作用機(jī)制的詳細(xì)研究報(bào)道不多,目前對(duì)芬太尼活性構(gòu)象的報(bào)道[9]中發(fā)現(xiàn),芬太尼結(jié)構(gòu)中的N-苯乙基和N-苯基基團(tuán)的取向?qū)钚詷?gòu)象貢獻(xiàn)較大.本文采用芬太尼及本課題組設(shè)計(jì)的小分子配體與阿片μ受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬,以研究配體與蛋白間的疏水作用、氫鍵作用等關(guān)系,探討其分子作用機(jī)制,對(duì)輔助設(shè)計(jì)新型高效鎮(zhèn)痛劑和其他特殊用途的化合物有一定的意義.

1 模型和計(jì)算方法

1.1 蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)源

我們前期的研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10],故阿片μ受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)采用Zhang等[11]用同源模建方法搭建的結(jié)構(gòu).該結(jié)構(gòu)以具有高解析度的視紫紅激酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)為模板(PDB代碼為:1F88).一般的GPCR受體經(jīng)過(guò)同源建模后需要進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化,目前,GPCR受體的MD模擬方法有兩種,一種是先構(gòu)建蛋白與脂水膜體系,然后用MD研究整個(gè)蛋白-膜-水體系.另一種是構(gòu)建蛋白-水體系,主要用來(lái)研究配體結(jié)合性[12].本文采用后一種方法.

1.2 復(fù)合物結(jié)構(gòu)對(duì)接與配體最優(yōu)構(gòu)象

在IBM IntelliStation POWER工作站上,采用AutoDock 4.0程序[13]對(duì)12個(gè)芬太尼受體激動(dòng)劑小分子與阿片μ受體進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接參數(shù):受體大分子的格點(diǎn)盒子大小為8 nm×8 nm×8 nm,格點(diǎn)間距為0.0375 nm,盒子中心位于受體中心,運(yùn)用Lamarckian遺傳算法,將局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合,以半經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)作為能量打分函數(shù),對(duì)小分子構(gòu)象和位置進(jìn)行全局搜索,對(duì)每個(gè)配體進(jìn)行128次獨(dú)立的對(duì)接實(shí)驗(yàn).遺傳算法程序關(guān)鍵參數(shù)為ga_pop_size 300 ga_num_evals 2500000,ga_run= 100,最后依據(jù)最低對(duì)接能和成簇分析的情況,選取合理的受體配體結(jié)合模式作為初步的復(fù)合物結(jié)構(gòu).

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬后再次對(duì)接

將MD模擬后得到的受體再次與配體進(jìn)行對(duì)接,復(fù)合物的結(jié)構(gòu)取MD達(dá)到穩(wěn)態(tài)后的平均構(gòu)象,然后從復(fù)合物結(jié)構(gòu)中提取出受體結(jié)構(gòu)和配體結(jié)構(gòu),再以新得到的受體按1.2節(jié)中的方法進(jìn)行分子對(duì)接操作.

1.4 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的分子動(dòng)力學(xué)研究

用GROMACS程序包[14]分別在水溶液體系中對(duì)12個(gè)芬太尼受體激動(dòng)劑和阿片μ受體蛋白受體復(fù)合物進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬研究.12個(gè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)為1.2節(jié)所述對(duì)接的結(jié)果.每個(gè)復(fù)合物的質(zhì)心位于立方體盒子中心,選擇溶質(zhì)原子到盒子壁的距離為0.7 nm,然后加入水分子,水分子選用SPC模型.采用GROMACS全原子力場(chǎng),用2 fs積分步長(zhǎng),用最陡下降法進(jìn)行了1000步的能量?jī)?yōu)化,然后在300 K下進(jìn)行了10000步的限制性動(dòng)力學(xué)優(yōu)化,最后采用2 fs的步長(zhǎng),使用熱浴耦合使系統(tǒng)溫度保持在300 K,用Maxwell分布產(chǎn)生.每隔100步記錄一次軌跡.在MD模擬中,用PME(Particle-Mesh Ewald electrostatics)方法處理靜電作用,范德華相互作用截?cái)喟霃饺?.9 nm,用SUNWAY計(jì)算機(jī)集群并行計(jì)算模擬1200 ps,直到能量達(dá)到穩(wěn)態(tài)為止.分別對(duì)蛋白環(huán)境和溶劑環(huán)境下激動(dòng)劑與環(huán)境之間相互作用能進(jìn)行系綜平均,從而計(jì)算出受體-配體結(jié)合自由能(ΔG)和結(jié)合常數(shù)(Ki).

1.5 連續(xù)介質(zhì)模型MM-PBSA方法計(jì)算復(fù)合物結(jié)合自由能

采用了MM-PBSA(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area)方法[15]計(jì)算復(fù)合物結(jié)合自由能,此方法采用分子力學(xué)和連續(xù)介質(zhì)模型估算復(fù)合物的結(jié)合自由能,并采用修正后的Robert Yang的Perl腳本[16]處理構(gòu)象,修正后的腳本排除了程序中讀取錯(cuò)誤.

MM-PBSA方法的計(jì)算方程式:

式(1)可以分為氣相能量項(xiàng)和溶劑能量項(xiàng),氣相能量項(xiàng)包含內(nèi)能項(xiàng)(EMM)和熵部分(TSMM)項(xiàng);溶劑能量項(xiàng)Gsolv可以分為極性(Gpolar,solv)和非極性(Gnon-polar,solv)項(xiàng),見(jiàn)式(2).用MD模擬后提取能量文件中的蛋白-蛋白電性和van der Waals相互作用而得到EMM項(xiàng).參考了文獻(xiàn)中的方法[17]考慮了在對(duì)接研究中不同復(fù)合物的熵相同而忽略了熵部分TSMM項(xiàng).本文根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果,計(jì)算復(fù)合物加權(quán)協(xié)方差矩陣再計(jì)算其熵部分?jǐn)?shù)值[14].極性和非極性項(xiàng)的計(jì)算則采用APBS軟件包[18],其電性項(xiàng)的參數(shù)grid-spacing取0.01 nm.使用GROMOS96 43a1力場(chǎng)參數(shù)設(shè)置原子電荷和半徑,探針半徑0.14 nm,復(fù)合物介電常數(shù)設(shè)為1,溶劑的介電常數(shù)設(shè)為80[19].非極性項(xiàng)Gnon-polar,solv采用溶劑可及表面(SSASA)方法計(jì)算:

其中γ=2.2 kJ·mol-1·nm-2,β=3.84 kJ·mol-1[20].每個(gè)復(fù)合物采用21個(gè)結(jié)合構(gòu)象,選取方法如下:在全部1200 ps模擬中,選取最后200 ps為平衡狀態(tài),即從1000 ps開(kāi)始(包含1000 ps)取樣,間隔為10 ps,選取一個(gè)結(jié)構(gòu),至1200 ps結(jié)束,共21個(gè)構(gòu)象[21],采用這21個(gè)構(gòu)象的極性和非極性項(xiàng)的平均值作為計(jì)算值.

2 結(jié)果與討論

2.1 阿片μ受體蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

人類(lèi)阿片μ受體蛋白有七個(gè)跨膜(TM)區(qū)段,屬于GPCR超家族.該受體由400個(gè)氨基酸殘基組成, TM2、TM3、TM7區(qū)和第2胞內(nèi)環(huán)區(qū)(IL2)具有較高的同源性,而TM1、TM4、TM5區(qū)則同源性較低.第2胞內(nèi)環(huán)和第3胞內(nèi)環(huán)區(qū)(IL2和IL3)是蛋白結(jié)合區(qū)域,這些區(qū)域在三種阿片受體中的高度相似性表明有與蛋白相互作用的可能性.阿片μ受體與κ、δ兩種阿片受體結(jié)構(gòu)的最大差異部分在氨基端、羧基端及第2、3胞外環(huán)區(qū)(EL2和EL3),這些區(qū)域可能是阿片受體配體結(jié)合區(qū),是不同配體選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).該推測(cè)已經(jīng)通過(guò)直接點(diǎn)突變得到證實(shí)[22].阿片μ受體三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1.

圖1 阿片μ受體蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 Protein structure of μ opioid receptor

圖2 芬太尼類(lèi)衍生物與μ阿片受體對(duì)接構(gòu)象Fig.2 Docking conformation of fentanyl analogs with μ opioid receptor

2.2 復(fù)合物對(duì)接及結(jié)合能的計(jì)算

通過(guò)對(duì)初步的分子對(duì)接結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)芬太尼配體分子間距離0.5 nm內(nèi)的參與配體相互作用比較重要的氨基酸有TM1區(qū)段上的Asp114、Ala117;TM3區(qū)段上的氨基酸Ile144、Ser145、Asp147、Tyr148、Asn150、Met151;TM5區(qū)段上的氨基酸His226、Ile230、Tyr234;TM6上Trp293、Asn296、His297、Tyr300、Arg303;TM7區(qū)段上的氨基酸Cys321、Ile322、Gly325、Tyr326等,所有參加作用的氨基酸編號(hào)見(jiàn)表1.12個(gè)芬太尼類(lèi)衍生物(包括已知活性在內(nèi)的4個(gè)芬太尼類(lèi)衍生物)和阿片μ受體蛋白的對(duì)接結(jié)果有多種取向和構(gòu)象,按照對(duì)接能量排序,我們發(fā)現(xiàn)低能構(gòu)象多集中于配體質(zhì)子化的N原子正電中心,并與TM3上的Asp147電負(fù)性中心發(fā)生相互作用(如圖2所示),此外還有幾個(gè)主要的作用殘基,分別為T(mén)M1的Asp114,TM3的Asp147,和TM6的His297,其中Asp147與芬太尼類(lèi)衍生物的哌啶季氨正電荷有電性作用,這些研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道[24]是一致的.

表1 各跨膜區(qū)段活性位點(diǎn)氨基酸Table 1 Amino acid of active pocket in transmembrane helices

圖3 羥甲芬太尼通過(guò)水分子的氫鍵介導(dǎo)的相互作用Fig.3 Interaction of ohmefentanyl with watermediate through extra-H-bond

表2 芬太尼及類(lèi)似物與MD模擬后受體的再對(duì)接結(jié)果Table 2 Re-docking results of fentanyl analogs after MD simulation

表3 芬太尼衍生物與阿片μ受體相互作用自由能Table 3 Free energy of interaction for fentanyl analogs and μ-opioid receptor complex

通過(guò)MD模擬研究,我們還發(fā)現(xiàn)復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)與無(wú)配體受體結(jié)構(gòu)有較大差異(圖2).因此,我們將MD模擬后得到的受體結(jié)構(gòu)再次與各自配體進(jìn)行分子對(duì)接研究,AutoDock 4.0再次對(duì)接后的計(jì)算結(jié)合能結(jié)果見(jiàn)表2.表2計(jì)算結(jié)果顯示,結(jié)合能除羥甲芬太尼(ohmefentanyl)外,其它與實(shí)驗(yàn)活性排序一致.我們分析認(rèn)為,羥甲芬太尼結(jié)構(gòu)中額外的羥基通過(guò)水分子介導(dǎo)與Tyr148殘基形成氫鍵(見(jiàn)圖3),而在對(duì)接過(guò)程中這個(gè)溶劑分子引入的額外的氫鍵未給予考慮,從而羥甲芬太尼對(duì)接評(píng)分排序與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不一致的.采用MM-PBSA方法,計(jì)算出的12個(gè)芬太尼類(lèi)衍生物的結(jié)合自由能,以及與它們對(duì)接計(jì)算的結(jié)果對(duì)比見(jiàn)表3.

用MM-PBSA方法計(jì)算得到的結(jié)合自由能,不但能夠?qū)σ种苿┑慕Y(jié)合強(qiáng)弱進(jìn)行正確的排序,而且計(jì)算得到的數(shù)值和實(shí)驗(yàn)數(shù)值能夠較好地符合.其中以芬太尼的計(jì)算結(jié)果最為接近,與本文前述AutoDock 4.0計(jì)算結(jié)果[13]相比較,MM-PBSA方法計(jì)算結(jié)果更為接近實(shí)驗(yàn)值,但計(jì)算數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)值仍略有偏差,除羥甲芬太尼外,計(jì)算值整體稍微偏高.

2.3 空載受體與復(fù)合物的MD模擬

2.3.1 空載受體的MD模擬

圖4 受體在2000 ps范圍的內(nèi)能變化Fig.4 Internal energy fluctuation of the receptor in 2000 ps

圖5 受體蛋白Cα位置的序列位置(δ)的RMS變化Fig.5 RMS fluctuation with the position of sequence number(δ)for receptor αRMS:root mean square

空載受體蛋白在MD模擬過(guò)程中均方根偏差(RMSD)值是衡量體系是否穩(wěn)定的重要依據(jù),α碳(Cα)和骨架的RMSD值在初始的100 ps內(nèi)變化大,隨后基本穩(wěn)定.蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)2000 ps的優(yōu)化達(dá)到穩(wěn)態(tài).本課題中以空載受體蛋白在1200 ps平衡后的平均構(gòu)象作為分子對(duì)接的基礎(chǔ)構(gòu)象,研究了其內(nèi)能的變化,如圖4所示.結(jié)果表明,體系的內(nèi)能變化不大,在短期模擬后即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),這可能是因?yàn)椴捎玫某跏冀Y(jié)構(gòu)已經(jīng)進(jìn)行了能量?jī)?yōu)化的原因,上述模擬結(jié)果表明我們所得系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài). MD模擬中的Cα空間位置均方根(RMS)漲落是反映分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)特征及柔性的一個(gè)重要參數(shù),RMS值越高,柔性越大,否則相反.從圖5所示的空載受體RMS圖可以看出,全部序列中有7個(gè)跨膜區(qū)段(分別以TM1-TM7標(biāo)示)柔性相對(duì)胞內(nèi)(標(biāo)示為IL)比胞外區(qū)(標(biāo)示為EL)低,其TM4、TM5跨膜區(qū)氨基酸在平衡態(tài)時(shí)仍有一定的柔性.受體蛋白的柔性可用Cα序列位置(δ)的RMS變化來(lái)衡量,即觀察蛋白的δ在模擬后與模擬前結(jié)構(gòu)的變化,用位置偏離的RMS均方根偏差來(lái)衡量,如果δ的RMS變化較大,說(shuō)明這些區(qū)段的柔性較大.如圖6所示.

2.3.2 復(fù)合物模擬結(jié)果及不同配體復(fù)合物模擬結(jié)果差異

圖6 受體蛋白骨架在2000 ps內(nèi)的RMSD變化Fig.6 RMSD change of receptor protein backbone in 2000 psRSMD:root-mean-square deviation

圖7 受體配體復(fù)合物在MD模擬期間能量(a)和骨架碳的RMSD(b)的變化Fig.7 Energy(a)and RMSD fluctuation(b)of receptor-liqand of complex C backbone in MD simulation

如圖7所示,以芬太尼受體復(fù)合物為例的所有復(fù)合物分子的模擬,總能量和勢(shì)能都很快達(dá)到穩(wěn)態(tài)狀態(tài).在開(kāi)始的500 ps內(nèi),RMSD變化稍大,500 ps后通過(guò)RMSD值變化可知,已基本達(dá)到平衡狀態(tài)(圖7(b)).這說(shuō)明復(fù)合物體系已經(jīng)穩(wěn)定.分析復(fù)合物的RMS數(shù)據(jù)(圖8)發(fā)現(xiàn),受體柔性較大的片段為T(mén)M1、TM4、TM5跨膜區(qū)段,而對(duì)活性口袋具有主要貢獻(xiàn)的TM2、TM3、TM6、TM7跨膜區(qū)段,結(jié)構(gòu)柔性較低,比較穩(wěn)定.

將芬太尼復(fù)合物蛋白部分在1200 ps內(nèi)的Cα與空載配體受體結(jié)構(gòu)Cα比較得知,復(fù)合物跨膜區(qū)段IL2、IL3(胞內(nèi)區(qū)段)和TM4區(qū)段構(gòu)象變化較大.分析復(fù)合物的RMS變化(圖8、圖9),發(fā)現(xiàn)結(jié)合配體后,受體TM1、TM3、TM6、TM7區(qū)段柔性降低(圖8),而IL2、IL 3(胞內(nèi)區(qū)段)EL3(胞外區(qū)段)和TM4的部分區(qū)段柔性增加,這說(shuō)明配體能夠穩(wěn)定受體TM1、TM3、TM6、TM7的構(gòu)象,通過(guò)改變?cè)黾硬糠謪^(qū)段構(gòu)象和柔性來(lái)激活受體,配體對(duì)受體結(jié)構(gòu)的影響不僅僅在活性區(qū),可能還通過(guò)一系列構(gòu)象和柔性變化影響到整個(gè)受體的功能,從而使蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詷?gòu)象而發(fā)揮作用.我們前期通過(guò)構(gòu)效關(guān)系和受體分子藥理學(xué)研究[26-29]表明,受體蛋白活性中心的變化影響生理活性的大小,最可能僅對(duì)剛性受體而言是正確的.本研究表明,對(duì)大多數(shù)柔性受體來(lái)說(shuō),非活性中心構(gòu)象的變化也將影響整個(gè)受體的活性構(gòu)象及其與藥物分子的相互作用,影響到藥物分子的生物活性.

圖8 芬太尼復(fù)合物的RMS變化Fig.8 RMS fluctuation of fentanyl complex

圖9 芬太尼復(fù)合物與受體骨架碳的RMS變化比較Fig.9 Comparison with RMS fluctuation of the fentanyl complex and receptor backbone C

圖10 對(duì)接評(píng)分高的復(fù)合物骨架碳的RMS變化Fig.10 RMS fluctuation of complex backbone C for high docking score complex

圖11 對(duì)接評(píng)分低的配體與受體結(jié)合后的RMS變化Fig.11 RMS fluctuation of low docking score after ligand binding receptor

不同配體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)RMS變化有差異. Carfentanil 24結(jié)合受體后,受體的TM6、TM7區(qū)段RMS變化小,結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,而IL2、IL3、EL3、TM4部分區(qū)段的RMS較高(如圖10所示),實(shí)驗(yàn)值較好的化合物在穩(wěn)定TM6、TM7區(qū)段跨膜蛋白結(jié)構(gòu)的同時(shí),還增加了其他蛋白區(qū)段的柔性,這些區(qū)段柔性和構(gòu)象的改變可能與蛋白功能有關(guān).

與受體結(jié)合能較低的配體2、21、22與受體結(jié)合后,受體各個(gè)區(qū)段的RMS變化都呈下降趨勢(shì),柔性降低(圖11).這種變化說(shuō)明配體2、21、22與受體結(jié)合后,使得受體結(jié)構(gòu)柔性整體降低,但是由于TM4、IL2、IL3柔性可能與活性構(gòu)象有關(guān),柔性整體降低不利于蛋白向活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變從而降低了活性.

2.3.3 結(jié)合配體后螺旋區(qū)的結(jié)構(gòu)變化與蛋白活性構(gòu)象

突變數(shù)據(jù)和分子對(duì)接的結(jié)果都表明TM2,TM3, TM7跨膜區(qū)段都參與了同配體的結(jié)合,因此有必要重點(diǎn)分析構(gòu)成活性口袋的螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)變化.如圖12所示,分析結(jié)合配體后受體螺旋區(qū)的RMSD的變化,發(fā)現(xiàn)結(jié)合配體后受體TM4、TM5的RMSD波動(dòng)較其他的幾個(gè)螺旋顯著.

圖12 受體與復(fù)合物蛋白結(jié)構(gòu)的變化Fig.12 Change of structure with receptor and complex proteinstructures overlapping between receptor and complex(a), receptor(b),and complex(c)

表4 各跨膜區(qū)段結(jié)合配體后氫鍵數(shù)量的變化Table 4 Change of hydrogen bonds of transmembrane helices after binding with ligand

我們還分析了經(jīng)歷同樣的MD模擬后,復(fù)合物和空載受體結(jié)構(gòu)中氫鍵數(shù)量的變化,發(fā)現(xiàn)結(jié)合配體后,受體螺旋區(qū)的氫鍵除TM5區(qū)段外,其他區(qū)段的氫鍵數(shù)量稍有增加,特別是在TM4片段,比空載受體增加了兩對(duì)氫鍵的相互作用,這與RMS變化分析中結(jié)合配體后引發(fā)TM4區(qū)段的變化相一致,而結(jié)合配體后整個(gè)體系氫鍵的相互作用增加,復(fù)合物與空載受體氫鍵數(shù)量比為63比55,見(jiàn)表4.

在空載受體TM1和TM7、TM2和TM7、TM2和TM3、TM5和TM6與TM6和TM7之間都有氫鍵的形成.經(jīng)過(guò)分析,這些螺旋之間形成氫鍵的現(xiàn)象在G蛋白偶聯(lián)受體家族中是普遍存在的.在結(jié)合配體之后,TM1和TM7、TM2和TM7、TM2和TM3、TM5和TM6跨膜區(qū)段之間的氫鍵作用消失,TM1和TM2、TM2和TM4跨膜區(qū)段之間的氫鍵作用增加,TM2、TM3、TM7是結(jié)合口袋所在的區(qū)域,我們推測(cè)這種氫鍵的消失和增加是受體活性構(gòu)象所必須的.配體與Asp147、Tyr148、Ile322、Gly325、Tyr326等氨基酸殘基之間發(fā)生的相互作用打破了原有螺旋片段之間的相互聯(lián)系,引起幾個(gè)TM區(qū)段之間發(fā)生較大程度的相對(duì)運(yùn)動(dòng),這種氫鍵作用關(guān)系的重構(gòu)可能是蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詷?gòu)象的重要因素.在配體分子進(jìn)入受體后,直接影響的是TM2、TM3、TM7跨膜區(qū)段,而隨后影響的是TM4區(qū)段,這樣使得下游的信號(hào)分子轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘臓顟B(tài),引起一系列的信號(hào)變化而激活G蛋白,從而引發(fā)生理效應(yīng).

3 結(jié)論

對(duì)一系列芬太尼類(lèi)化合物與阿片μ受體蛋白進(jìn)行分子對(duì)接,討論了各配體與μ受體進(jìn)行對(duì)接后蛋白質(zhì)的構(gòu)象,在分子動(dòng)力學(xué)模擬基礎(chǔ)上,采用MM-PBSA方法進(jìn)行了自由能排序,得出了已知活性分子的排序,具有比較好的預(yù)測(cè)能力,并與實(shí)驗(yàn)值較接近.

對(duì)復(fù)合物進(jìn)行的分子動(dòng)力學(xué)模擬研究發(fā)現(xiàn),受體與小分子配體結(jié)合后影響了非口袋區(qū)的蛋白構(gòu)象.從蛋白結(jié)構(gòu)不同區(qū)段的RMS變化分析發(fā)現(xiàn), TM4跨膜區(qū)段和EL1胞外區(qū)的構(gòu)象改變較大,這是與傳統(tǒng)活性構(gòu)象不同之處.

通過(guò)探討復(fù)合物與受體氫鍵的變化,發(fā)現(xiàn)與配體結(jié)合后,復(fù)合物氫鍵的數(shù)目較單一受體略有增加,原有的TM4區(qū)段的氫鍵關(guān)系有所變化,推測(cè)TM4區(qū)段氫鍵的變化可能是蛋白活性構(gòu)象改變的重要因素.

用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果結(jié)合MM-PBSA方法計(jì)算自由能作為評(píng)分依據(jù),能得到比較好的理論預(yù)測(cè)結(jié)果,這些為藥物分子設(shè)計(jì)提供了重要的理論基礎(chǔ).

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May 8,2009;Revised:September 8,2009;Published on Web:November 25,2009.

Molecular Docking and Molecular Dynamics Simulations of Fentanyl Analogs Binding to μ-Opioid Receptors

LI Bo1LIU Ming2HU Wen-Xiang1,*
(1Institute of Physical Organic and Medicinal Chemistry,Capital Normal University,Beijing 100048,P.R.China;2College of Life Science,Capital Normal University,Beijing 100048,P.R.China)

Weperformedmoleculardockingandmoleculardynamics(MD)simulations to investigate the interactions between fentanyl analogs and μ-opioid receptors.The AutoDock 4.0 program was used to perform the docking and homology modeling of the μ-opioid receptor structure.MD method as implemented in the GROMACS program was used to model the twelve fentanyl receptor agonists and the μ-opioid receptor protein compounds in water and to optimize the docking complex structure.Based on MM-PBSA methods,the APBS program was used to calculate the binding affinity of the complexes and the binding contant of receptor and liqand(Ki)values determined using MMPBSA were consistent with the experimental values.Our predictions of compound activity sequences were,therefore, correct.The MD simulations of these complexes revealed that the protein structures in the complexes differed substantially from the structures of the ligand-free receptors.The backbone of the intracellular region segments IL2, IL3 and TM4 showed that the skeleton conformations had changed significantly.Different compounds may influence the receptor structure differently.Compounds with high activities may enhance binding flexibility in certain protein structural regions.These facts imply that fentanyl analogs may result in μ-opioid receptors changing to an active conformation after receptor binding.Physiologic effects may thus be triggered by a mediating signal transduction and by the activation of the G-protein.

Molecular dynamics; Fentanyl; μ-opioid receptor; Molecular docking

O643

*Corresponding author.Email:huwx66@163.com;Tel:+86-10-68904756.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20872095).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20872095)資助項(xiàng)目