芋莖尖離體培養(yǎng)再生體系建立

劉獨臣，房超，李躍建，劉小俊，梁根云，楊宏

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，四川成都，610066）

“烏桿槍”是四川主栽的一個水芋地方品種，屬多籽芋。該品種晚熟、產(chǎn)量高、耐澇、耐蔭、耐儲藏、球莖肉質(zhì)細軟粘滑，品質(zhì)好。在四川廣泛種植，深受消費者喜愛。該品種長期由農(nóng)民自繁留種，品種退化嚴重，而且病毒病普遍發(fā)生，嚴重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)。采用組織培養(yǎng)技術(shù)進行芋脫毒快繁的研究已有報道[1～4]。本試驗通過對四川芋烏桿槍莖尖離體培養(yǎng)的一系列影響因子的研究，旨在通過芋莖尖再生體系的建立，脫毒復(fù)壯四川地方芋優(yōu)良品種，為四川芋生產(chǎn)提供優(yōu)良種源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四川省水芋主栽品種烏桿槍，2007年種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜室雙流試驗基地。2008年1月取回置于實驗室植物培養(yǎng)箱內(nèi)，催芽待用。

1.2 試驗方法

①外植體的獲得 在培養(yǎng)箱內(nèi)25℃左右催芽，待芽長到0.5～1 cm大小時，剜割飽滿的頂芽或側(cè)芽，先用洗滌劑清洗，再用自來水沖洗2 h以上。在超凈工作臺上用75%酒精表面消毒30 s，剝?nèi)ネ鈱喻[片，0.1%氯化汞消毒15～20 min，用無菌水沖洗5次，濾紙吸干，剝?nèi)?.2～0.3 cm 的莖尖生長點，接種到培養(yǎng)基上。

②分化培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加細胞分裂素 6-芐基腺嘌呤（6-BA）、苯基噻二唑基脲（TDZ）與萘乙酸（NAA）配成不同濃度的激素組合，瓊脂0.7%，蔗糖 3%。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度 2 000～2 500 lx，光照12 h/d。每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計外植體叢芽誘導(dǎo)率，觀察不定芽誘導(dǎo)的分化情況。

③繼代培養(yǎng) 將誘導(dǎo)出的不定芽叢切成單芽接種于繼代增殖培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)基以MS加二倍鐵鹽為基本培養(yǎng)基（2FeMS）添加不同濃度的6-BA，TDZ和NAA。繼代時間15 d，繼代3次后統(tǒng)計增殖情況。

④生根培養(yǎng) 將高2 cm以上生長健壯的芋苗切割轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為MS添加不同濃度BA和NAA的固體或液體培養(yǎng)基。30 d后統(tǒng)計生根率，觀察生根情況。將生根良好的壯苗開瓶煉苗1～2 d，洗凈根系培養(yǎng)基，移栽到營養(yǎng)缽中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)分化

剝?nèi)∏o尖接種到不同的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。試驗結(jié)果表明，不同的細胞分裂素對誘導(dǎo)芋莖尖分化產(chǎn)生不定芽的能力和數(shù)量有差異。在添加6-BA的培養(yǎng)基中，7 d左右外植體轉(zhuǎn)綠膨大，40 d左右叢芽分化，很少見愈傷組織。在添加TDZ的培養(yǎng)基中，3 d左右外植體轉(zhuǎn)綠膨大，25 d左右叢芽分化，有少量愈傷出現(xiàn)。從表1可以看出，6種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)出不定芽，但是TDZ與NAA的激素組合在不定芽分化率和增殖率上都明顯高于6-BA與NAA的激素組合，表明TDZ在芋分化誘導(dǎo)培養(yǎng)中優(yōu)于6-BA。在TDZ與NAA的組合中，以 1.0 mg/L的 TDZ與 0.2 mg/L的 NAA組配時，不定芽誘導(dǎo)率最高，達到了80%，增殖系數(shù)也最大。隨著TDZ濃度的降低，不定芽分化率和增殖率都相對降低，但是，TDZ濃度變化對不定芽分化率影響不大，對增殖率的影響顯著，TDZ濃度從1.0 mg/L降低到 0.1 mg/L 時，增殖系數(shù)從 7.5 降到了 3.6，表明TDZ的有無在前期芋莖尖分化萌動中起關(guān)鍵作用，濃度變化主要影響增殖率。由此可見，6-BA和TDZ這2種不同細胞分裂素與NAA分別組配后，以TDZ對芋莖尖分化不定芽最為有效，以MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L誘導(dǎo)分化和增殖效果最好。

表1 不同培養(yǎng)基對芋分化培養(yǎng)的影響

表2 不同培養(yǎng)基對芋叢生芽繼代培養(yǎng)的影響

表3 不同生根培養(yǎng)基對芋苗生根移栽的影響

2.2 叢芽繼代培養(yǎng)

將分化的叢芽切割成單芽，繼代于增殖培養(yǎng)基上。試驗結(jié)果表明，增殖繼代時，在添加6-BA的培養(yǎng)基中，叢芽發(fā)生慢，但是生長良好，單芽25 d長度達到2～3 cm；在添加TDZ的培養(yǎng)基中，叢芽發(fā)生快，苗相對較短，不能一次成苗的簇生芽多（不納入增殖系數(shù)的計算）。在最初的幾次繼代后，無論在哪一種培養(yǎng)基中，增殖系數(shù)都有所下降，當(dāng)用不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的空白二倍鐵鹽的MS繼代2次后，增殖能力恢復(fù)。從表2可以看出，在6種繼代培養(yǎng)基中，2FeMS+TDZ 1.0 ～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L增殖效果最好，但添加6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的增殖系數(shù)也在 3.1～5.7。由于TDZ商品售價高，并且在大量的培養(yǎng)基中添加TDZ相當(dāng)麻煩，所以在繼代中用2FeMS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 也很好。

2.3 生根培養(yǎng)與移栽

將誘導(dǎo)分化出的健壯小苗接種到生根培養(yǎng)基上。試驗結(jié)果表明，單獨用添加0.1～0.5 mg/L NAA的生根效果不好。在生根培養(yǎng)基中添加了微量的6-BA對生根有促進作用。在相同激素培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)和固定培養(yǎng)生根率相差不大，在液體培養(yǎng)基中生根快，根的數(shù)量多、整齊度好，但在固體培養(yǎng)基上生根的芋苗移栽存活率更高。從表3可以看出，芋苗在MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 固體培養(yǎng)基上生根效果最好，生根率為100%，移栽后存活率也最高。

3 小結(jié)

本試驗結(jié)果表明，低濃度的TDZ在芋莖尖分化誘導(dǎo)過程中，對促進莖尖萌動、誘導(dǎo)不定芽的效果好于高濃度的6-BA，這和已有的研究結(jié)論是一致的[5]。但是在繼代增殖培養(yǎng)中，TDZ的增殖系數(shù)比6-BA高，應(yīng)用前景好。

在本試驗中，在芋苗生根培養(yǎng)添加微量的6-BA是必要的，不添加6-BA時，生根率很低。利用液體培養(yǎng)生根效果不錯，這和前人的研究結(jié)果一致[6]，但移栽存活率較低，如加以改善，既可節(jié)約成本，又能簡化移栽程序，有深入研究意義。

[1]楊乃博.芋的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，1994，30（5）：357.

[2]劉玉平，柯衛(wèi)東，黃新芳，等.芋的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，1999，35（5）：378-379.

[3]柏新富，蔣小滿，畢可華，等.芋脫毒苗的組培快繁及田間試驗[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2002，8（1）：52-55.

[4]劉玉平，柯衛(wèi)東，黃新芳，等.試管芋誘導(dǎo)的研究[J].園藝學(xué)報，2003，30（1）：43-46.

[5]崔瑾，李式軍.苯基噻二唑基脲（TDZ）和瓊脂對芋莖尖生長的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（6）：82-83.

[6]黃萍萍，林金虎,張志勇，等 “六月紅”早熟芋快速繁殖技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，19（8）：72-73.