一種快速觀察美味黑穗菌菌絲的新方法

褚福強，張敬澤，郭得平

（1.浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州，310029；2.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系）

美味黑穗菌(Ustilago esculenta)是寄生在菰草（Zizania latifolia）上的一種活體營養(yǎng)型真菌。美味黑穗菌侵染菰草后在莖的上部產(chǎn)生膨大結(jié)構(gòu)，稱為茭白，作為水生蔬菜而廣泛種植。真菌侵染寄主后與寄主建立和諧的營養(yǎng)關(guān)系，以菌絲體的形式完成它的整個生活史，不像其他黑穗菌引起明顯的癥狀[1～2]。然而，在人工栽培條件下，菰草可能逃避了美味黑穗菌侵染，不形成膨大結(jié)構(gòu)，這些植株在生產(chǎn)上也被稱為雄茭[3]。但迄今還不清楚雄茭形成的機制，早期診斷茭白和雄茭主要依據(jù)種植者經(jīng)驗和植株形態(tài)學(xué)細微特征，缺乏準(zhǔn)確、迅速區(qū)分它們的有效手段。雖然一些細胞學(xué)研究為理解真菌與寄主互作的分子機制研究提供了細胞學(xué)基礎(chǔ)，也為早期診斷茭白和雄茭提供了技術(shù)手段。但原先的細胞學(xué)觀察需要復(fù)雜的樣品處理過程（包括樣品固定、系列脫水、包埋和切片等步驟）和相關(guān)設(shè)備[4，2]，限制了這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

因此，本文主要報道一種簡單、快速觀察美味黑穗菌菌絲的新方法。利用該方法，不僅能有效觀察真菌在寄主中的菌絲形態(tài)、菌絲分布，也能用于早期快速、準(zhǔn)確診斷茭白和雄茭植株，也為研究雄茭形成的機制提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茭白品種浙茭2號和雄茭植株均來自浙江大學(xué)試驗農(nóng)場。

1.2 樣品處理

分別從茭白和雄茭植株的不同部位（茭白、莖、根、芽和葉鞘）取樣，用徒手切片切取組織樣品，每個樣品截面大小為 0.5 cm×0.4 cm，厚 20～30 μm。樣品處理采用修改的Latude-Dada（1996）方法，包括樣品脫色和染色過程。樣品首先在脫色液（0.15%三氯乙酸溶解在3∶1（w/v）的乙醇和氯仿混合液中）中脫色，脫色時間依賴材料幼、老程度。收獲時期的茭白脫色時間為 14～16 h，成熟的根、莖為 18～20 h，幼嫩葉鞘和芽為14 h。樣品脫色后用蒸餾水漂洗3次，隨后進行染色。用0.025%苯胺藍乳酚油染色液對樣品染色，染色時間依據(jù)材料的著色程度而定。收獲時期的茭白、成熟的根和莖染色時間為3～4 h，幼嫩葉鞘和芽為4～5 h。染色后用蒸餾水對染色樣色沖洗3次，然后用20%的甘油作浮載劑制片。如果個別樣品染色過深，可將樣品從載玻片再移入蒸餾水，在水平搖床上震蕩褪色約1～2 h（視著色程度而定），或用70%的酒精代替蒸餾水進行褪色5～10 min（隨后用蒸餾水漂洗3次）。

1.3 細胞學(xué)觀察

細胞學(xué)觀察和照相在具有Axiocam CCD攝像頭和Axiovision數(shù)字成像軟件（AxioVision Software Release 3.1.,ver.3-2002；Carl Zeiss Vision Imaging Systems）的Zeiss Axiophot 2顯微鏡上進行。以上處理的樣品也可直接用于共聚焦顯微鏡[激光掃描共聚焦顯微鏡Leica TCS-SP 59（具有HCX PL APO CS 63×NA 1.3 glycerol immersion objective）]觀察。

2 結(jié)果與分析

采用修改的Latude-Dada方法處理茭白植株樣品，可清楚觀察到美味黑穗菌在茭白植株不同器官中的菌絲分布。圖1顯示了真菌分布在茭白、莖、葉鞘和芽的維管束組織和薄壁組織中，這些正如原先描述的。但和原先的方法相比較，該方法由于對組織進行了脫色，增加了視野的景深，可觀察到更多層次的信息，使圖像有較強的立體感；而原先方法獲得的圖像僅是一個截面上的信息。所有該方法獲得的圖像，能提供真菌菌絲在寄主組織內(nèi)更豐富的信息，擴大了理解真菌與寄主互作的細胞學(xué)特征視野。

真菌主要沿著寄主細胞間擴展，也可侵入寄主細胞中，通常在菌絲頂端產(chǎn)生不規(guī)則的、短而多的分枝，稱為菌絲簇（hyphal clusters）；也可能產(chǎn)生大量的、類似酵母的細胞，形成菌絲聚集體（hyphal aggregations）。在成熟和幼嫩的組織中，真菌都能形成菌絲聚集體或菌絲簇。所以，美味黑穗菌在茭白植株中產(chǎn)生聚集體和菌絲簇是一個普遍特征。相比較，在雄茭植株不同器官上，都沒有真菌菌絲存在。

由于苯胺藍具有發(fā)色團，使切片組織細胞著色后，直接可在共聚焦顯微鏡下觀察。在共聚焦顯微鏡下，圖2清楚顯示茭白芽組織中一個激光掃描縱截面——維管束中的真菌菌絲可沿著細胞間向維管束間組織擴展，并在薄壁束鞘（parenchymoutous bundle sheath）細胞間形成菌絲聚集體。同樣，該方法處理的樣品在共聚焦顯微鏡下不僅可獲得二維圖像數(shù)據(jù)，也可經(jīng)計算機圖像處理三維重建軟件重新組，獲得標(biāo)本的三維結(jié)構(gòu)，揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系（沒有顯示圖）。

3 小結(jié)與討論

本文采用修改的Latude-Dada（1996）方法。該方法已廣泛用于研究炭疽菌屬種（Colletotrichum species）在侵染寄主過程中的細胞學(xué)特征的觀察[5～6]，但這些研究僅限于在寄主葉片上。本文研究表明，該方法用于組織切片，也能取得很好的染色效果。

如何減少雄茭的形成，是生產(chǎn)上亟待解決的問題。但由于雄茭形成機制研究的滯后，這一問題還未從根本上解決。然而，細胞學(xué)研究是觀察植物成功地逃脫真菌侵染的最直接的方法，而本研究提供了研究雄茭形成機制的技術(shù)手段。

[1]Chung K R,Tzeng D D.Nutritional requirements of the edible gall-producing fungus Ustilago esculenta[J].J Biol Sci,2004,4:246-252.

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圖1 美味黑穗菌在浙茭2號品種不同器官中的菌絲分布顯微圖

圖2 共聚焦顯微圖顯示美味黑粉穗菌在浙茭2號品種幼芽中的菌絲分布