RBP4對游泳訓(xùn)練大鼠脂肪細(xì)胞IR和IRS-1蛋白表達(dá)和磷酸化的影響

張明軍

RBP4對游泳訓(xùn)練大鼠脂肪細(xì)胞IR和IRS-1蛋白表達(dá)和磷酸化的影響

張明軍

目的：觀察視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）對大鼠脂肪細(xì)胞IR和IRS-1蛋白表達(dá)和磷酸化的影響。方法：RBP4孵育8周游泳運動組和安靜對照組大鼠（8周齡SD）脂肪細(xì)胞，檢測脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取、IR和IRS-1蛋白表達(dá)和磷酸化。結(jié)果：RBP4孵育后，運動組大鼠脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖攝取率顯著高于安靜對照組，游泳運動組和安靜對照組大鼠脂肪細(xì)胞IR蛋白表達(dá)、磷酸化和IRS-1蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)差異。RBP4孵育后，運動組大鼠脂肪細(xì)胞IRS-1磷酸化程度較安靜對照組顯著增加。結(jié)論：8周游泳運動能夠增加RBP4孵育后的大鼠脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取和IRS-1磷酸化程度，改善RBP4誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗。

游泳運動；視黃醇結(jié)合蛋白4；胰島素抵抗；胰島素受體；胰島素受體底物

胰島素受體（IR）與胰島素結(jié)合后酪氨酸殘基發(fā)生自磷酸化，為下游的船塢蛋白（docking protein）提供結(jié)合位點，這些下游蛋白隨后發(fā)生一系列的磷酸化，將胰島素信號向下游傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的葡萄糖攝取和其他代謝功能，胰島素受體底物（IRS）即是這種蛋白中的一類。胰島素信號傳導(dǎo)缺陷是胰島素抵抗發(fā)生的主要原因，為了順利傳導(dǎo)胰島素信號，胰腺β細(xì)胞分泌更多的胰島素，最終β細(xì)胞功能失代償，出現(xiàn)2型糖尿病。胰島素抵抗細(xì)胞的受體、受體底物數(shù)量和磷酸化程度會隨著細(xì)胞外胰島素濃度的改變而發(fā)生相應(yīng)變化，以適應(yīng)胰島素濃度的增加[1]，在一定程度上維持胰島素功能的正常發(fā)揮。

視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）是一個新發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致胰島素抗性的脂肪因子，在胰島素抗性發(fā)展中起到一個關(guān)鍵作用，具有胰島素抗性的小鼠和患有肥胖和2型糖尿病的病人體內(nèi)，血清RBP4的水平是升高的[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)：2型糖尿病大鼠附睪脂肪中RBP4mRNA和蛋白表達(dá)增加，循環(huán)RBP4水平升高，出現(xiàn)胰島素抵抗，8周游泳運動能夠降低2型糖尿病大鼠附睪脂肪中RBP4mRNA、蛋白表達(dá)和循環(huán)RBP4水平，緩解胰島素抵抗[3]。為探討運動如何通過影響RBP4而改善胰島素抵抗，本研究對運動大鼠脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在體外觀察RBP4對脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運以及對IR和胰島素受體底物1（IRS-1）蛋白表達(dá)和磷酸化的影響，探索運動改善胰島素抵抗的新機(jī)制。

1 研究材料與方法

1.1 材 料

胰島素、2-Deoxy-D-[I-3H]-glucose購自Biogenesis（Poole，UK）；抗胰島素受體（IR）、胰島素受體底物1（IRS1）抗體，抗IR磷酸化（Y1355）和IRS-1（Ser 307）磷酸化抗體均購自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA），相應(yīng)的Ⅱ抗體均購自北京中杉金橋公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 大鼠脂肪細(xì)胞的分離和活性檢測 SD雄性大鼠，8周齡，體重180～210 g，上海斯萊克實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（滬）2003-0003。隨機(jī)分為游泳運動組和安靜對照組，每組12只。運動組按照Ploug方法[4]訓(xùn)練8周，每周訓(xùn)練5天，每天無負(fù)重游泳60 min。安靜對照組大鼠浸水后撈出。第8周末運動后斷頭處死大鼠，參照Rodbel[5]方法分離24只大鼠附睪脂肪細(xì)胞，分別配制成24份1×106個/mL的細(xì)胞懸液，0.4%臺盼藍(lán)1∶9與細(xì)胞懸液混合，3 min內(nèi)計數(shù)活脂肪細(xì)胞（未著色細(xì)胞）占總脂肪細(xì)胞數(shù)百分比，結(jié)果顯示存活率大于99%。

1.2.2 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)、RBP4孵育和葡萄糖攝取率的檢測 取計數(shù)的24份大鼠脂肪細(xì)胞懸液0.5 mL，分別加入聚丙烯培養(yǎng)管中37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，貼壁后，12份運動大鼠細(xì)胞分為等數(shù)的2組，分別加入40 μg/L+25 mmol·L-1D葡萄糖，胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖攝取組加入10 U·L-1胰島素，基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖攝取組不添加胰島素。12份安靜大鼠細(xì)胞分組方式與運動組相同。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，冰硅油終止反應(yīng)，離心除去下層培養(yǎng)液，液閃計數(shù)儀測定脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率。各組內(nèi)同比重復(fù)2次，實驗共重復(fù)5次。

1.2.3 脂肪細(xì)胞胰島素刺激狀態(tài)下IR和IRS-1蛋白表達(dá)的檢測 取運動組和安靜對照組胰島素刺激狀態(tài)下脂肪細(xì)胞，分別經(jīng)PBS洗2次，使用細(xì)胞溶解液消化1 h，離心15 min（4℃、12 000ⅹg），采取上清液放入-80℃中保存?zhèn)溆?。West bloting法測定IR和IRS-1蛋白表達(dá)，100 ug細(xì)胞溶解物SDS-PAGE蛋白分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。在室溫用5%低脂奶粉PBS液封膜3 h。加入抗IR或抗IRS-1抗體（工作濃度1∶4 000）4℃孵育過夜，洗滌后加入相應(yīng)辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗（工作濃度1∶5 000）分別孵育1 h，洗膜方法同前。充分洗滌后與ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑，英國Amersham）反應(yīng)，即刻與KadakX-Omat底片曝光洗片后用LeicaQ550-IW圖像分析儀（德國）進(jìn)行掃描，測定光密度，進(jìn)行定量分析。

1.2.4 脂肪細(xì)胞IR和IRS-1磷酸化的檢測 免疫沉淀檢測IR和IRS-1的磷酸化程度：細(xì)胞內(nèi)總蛋白的提取及濃度測定方法同前；各取100 μg總蛋白，分別加入抗IR和IRS-1抗體（工作濃度1∶2 000），4℃孵育輕搖過夜，加入100 μL10%A-Sepharose進(jìn)行沉淀，洗滌免疫沉淀復(fù)合物后加入50 μL2×SDS上樣緩沖液煮沸5 min；離心3 min，取上清，按前述方法電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過夜，加抗磷酸酪氨酸抗體（工作濃度1∶1 000），洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（工作濃度1∶5 000）；曝光，洗片，其分析方法同上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以SPSS11.0版進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性采用Levene檢驗，運動組與安靜對照組進(jìn)行獨立樣本T檢驗，雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1 脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的變化

RBP4孵育后，與安靜組脂肪細(xì)胞相比，運動組脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下（未添加胰島素）和胰島素刺激狀態(tài)下的葡萄糖攝取率顯著增加（P<0.01）（見表1）。

表1 RBP4對脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的影響Table 1 Effects of RBP4 on glucose uptake in lipocyte

2.2 脂肪細(xì)胞IR、IRS-1蛋白表達(dá)和磷酸化變化

RBP4孵育后，胰島素（10U·L-1）刺激狀態(tài)下，運動組和安靜對照組脂肪細(xì)胞IR蛋白表達(dá)和磷酸化程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；運動組和安靜對照組脂肪細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與安靜對照組相比，運動組脂肪細(xì)胞IRS-1磷酸化程度顯著增加（P<0.01）（見圖1-圖3）。

3討 論

RBP4是最近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，與胰島素抵抗的關(guān)系密切。Graham和Qin Yang發(fā)現(xiàn)RBP4與胰島素抗性的發(fā)生存在某種聯(lián)系，通過運動而改善了胰島素敏感性的人和小鼠，其血清中RBP4水平也降低[6]。脂肪細(xì)胞是對胰島素敏感的靶細(xì)胞之一，常作為胰島素抵抗機(jī)制的研究模型，其對胰島素敏感性的改變表現(xiàn)為胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖轉(zhuǎn)運能力的改變[7]。胰島素刺激的脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運是通過IR、IRS、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和葡萄糖轉(zhuǎn)運子（GLUT）等一系列信號傳導(dǎo)過程完成的，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的任何一個環(huán)節(jié)異常均可以引起胰島素抵抗。

為研究運動如何通過影響RBP4而改善胰島素敏感性，我們在體外復(fù)制了高RBP4生理環(huán)境，建立脂肪細(xì)胞模型，誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗，觀察運動組和安靜對照組大鼠脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率變化情況。研究結(jié)果顯示，RBP4對運動組大鼠脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)和胰島素刺激狀態(tài)下葡萄糖轉(zhuǎn)運的抑制程度明顯比安靜對照組輕，表明運動組脂肪細(xì)胞耐受RBP4的能力高于安靜對照組，運動組脂肪細(xì)胞胰島素敏感性高于安靜對照組，提示運動能夠改善RBP4誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，但其作用機(jī)制尚不清楚。

胰島素作用于脂肪細(xì)胞，將胰島素信號通過胰島素受體實現(xiàn)跨膜傳遞，IR通過膜外部分與胰島素結(jié)合，使包括IR、IRS在內(nèi)的一系列物質(zhì)磷酸化，胰島素信號得以傳入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、繁殖、分化及代謝的生理功能。高RBP4水平能夠誘導(dǎo)大鼠脂肪細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗，表現(xiàn)出葡萄糖轉(zhuǎn)運效率下降，而8周游泳運動則能夠改善大鼠脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率，提高胰島素敏感性，提示與胰島素信號傳遞有關(guān)的信號蛋白表達(dá)量發(fā)生變化或功能得到改善。為了觀察高RBP4狀態(tài)下，運動大鼠脂肪細(xì)胞IR蛋白表達(dá)變化情況，探索運動改善RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗的機(jī)制，給予大鼠脂肪細(xì)胞RBP4孵育后，我們檢測了胰島素刺激后大鼠脂肪細(xì)胞IR蛋白表達(dá)和磷酸化的變化，結(jié)果顯示，RBP4同等程度地抑制了運動組和安靜對照組大鼠脂肪細(xì)胞IR蛋白表達(dá)和磷酸化。IR是細(xì)胞膜受體，與胰島素結(jié)合后激活亞基內(nèi)的受體酪氨酸蛋白激酶，再通過磷酸化細(xì)胞內(nèi)的底物如IRS-1和PI3K等介導(dǎo)包括葡萄糖轉(zhuǎn)運，糖原合成等信號傳遞途徑。Danielsson A等[8]研究顯示，無論是RBP4孵育正常人或糖尿病者的脂肪細(xì)胞后，并沒有影響IR的磷酸化而改變胰島素敏感性。提示RBP4引起的胰島素信號傳導(dǎo)鏈缺陷并不是發(fā)生在IR環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果也提示：與安靜對照組相比，8周游泳運動沒有增加RBP4孵育后的大鼠脂肪細(xì)胞IR蛋白表達(dá)和磷酸化，運動改善RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗機(jī)制與IR變化無關(guān)，推測IR的下游信號蛋白IRS的變化可能在這一調(diào)節(jié)機(jī)制中扮演重要角色。

為進(jìn)一步確定運動改善RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗的作用位點，本研究選擇IRS-1蛋白作為研究對象，觀察RBP4對大鼠脂肪細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)和磷酸化的影響，結(jié)果顯示，RBP4同等程度地抑制了安靜對照組和運動組大鼠脂肪細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)，但RBP4對運動組大鼠脂肪細(xì)胞IRS-1蛋白磷酸化的抑制程度顯著低與安靜對照組，提示RBP4孵育后，運動大鼠脂肪細(xì)胞IRS-1在胰島素刺激后的磷酸化程度高于安靜對照組，其作用位點和Anita Ost等[9]對人脂肪細(xì)胞研究的結(jié)果一致。IRS是IR酪氨酸激酶的底物，也是胰島素信號傳遞的中介，IRS家族系列中，IRS-1在胰島素信號傳遞過程發(fā)揮重要作用。IRS-1表達(dá)量和磷酸化程度的改變都對胰島素抵抗產(chǎn)生影響，研究證明：IRS-1基因剔除小鼠均表現(xiàn)出胰島素抵抗癥狀[10]。脂肪組織是胰島素作用的主要外周靶組織之一，肥胖患者的脂肪細(xì)胞IRS-1表達(dá)降低，胰島素作用減弱，出現(xiàn)胰島素抵抗[11]，在一些多囊卵巢綜合征合并胰島素抵抗患者子宮內(nèi)膜IRS-1蛋白的表達(dá)也明顯降低[12]。所以，IRS-1mRNA穩(wěn)定性降低、表達(dá)的減少和編碼區(qū)變異導(dǎo)致的IRS功能減弱，都可以引起胰島素抵抗。隨后對2型糖尿病病人的研究也證實了IRS-1磷酸化和胰島素抵抗的關(guān)系，在骨骼肌被注射胰島素以后，IRS-1酪氨酸磷酸化程度顯著低與正常人[13]。本研究顯示，RBP4孵育后，運動組與安靜對照組大鼠脂肪細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)量無顯著性差異，而胰島素刺激下的葡萄糖攝取率卻顯著增加，推測脂肪細(xì)胞IRS-1蛋白表達(dá)量的變化沒有在運動改善RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗機(jī)制中發(fā)揮作用，而脂肪細(xì)胞IRS-1磷酸化程度的增加則合理的解釋了運動改善RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗的作用機(jī)制。

綜上所述，8周游泳運動后，大鼠脂肪細(xì)胞對RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗的耐受能力提高，表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率增加，脂肪細(xì)胞IRS-1磷酸化程度增加，提示8周游泳運動能夠通過增加脂肪細(xì)胞IRS-1磷酸化來改善RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗。本研究不足在于僅僅分析了脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對于葡萄糖轉(zhuǎn)運的其他重要部位，如骨骼肌、肝細(xì)胞的情況未做探討，而且體外實驗研究也不能完全模仿體內(nèi)胰島素作用的生理環(huán)境，所以研究結(jié)果存在局限性。至于運動干預(yù)后，RBP4是否還會影響其他胰島素信號蛋白和酶的活性，則有待進(jìn)一步研究。

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Effects of RBP4 on Protein Expression and Phosphorylation of IR and IRS-1 in Swimming Rats Lipocyte

ZHANG Mingjun
(School of Sports Sciences,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China)

Objective:To observe the influence of RBP4 on protein expression and phosphorylation of IR and IRS-1 in rats'lipocyte.Methods:Rats lipocyte (eight weeks SD)of eight weeks swimming rats and control rats were incubated by RBP4.Glucose uptake,protein expression and phosphorylation of IR and IRS-1 in lipocyte were measured.Results:The insulin-stimulated glucose uptake and noninsulin-stimulated glucose uptake increased more in exercise rats than in control rats after RBP4 incubation,respectively.There was no difference between protein expression of IR,IRS-1 and phosphorylation of IR in exercise rats and control rats.Phosphorylation of IRS-1 increased more in exercise rats than in control rats after RBP4 incubation.Conclusion:Eight weeks swimming could increase glucose uptake and phosphorylation of IRS-1 in rat lipocyte after RBP4 incubation respectively,and improve RBP4-induced insulin resistance.

swimming;retional-binding protein-4;insulin resistance;insulin receptor;insulin receptor substrate1

G 804.2

A

1005-0000（2010）01-0038-03

2009-07-27;

2009-09-10；錄用日期：2009-09-11

福建省教育廳科技項目(項目編號:JB08221)

張明軍（1968-），男，安徽滁州人,莆田學(xué)院講師、醫(yī)師，福建師范大學(xué)在讀博士研究生。

莆田學(xué)院體育系，莆田351100。