耐力訓練對AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表達的影響

謝 謹，龔豪杰，張 纓

耐力訓練對AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表達的影響

謝 謹1，龔豪杰1，張 纓2

目的：研究耐力訓練對AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達的影響，探討耐力訓練中AMPKα2調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的可能途徑。研究方法：兩月齡C57BL/6J野生（WT）和AMPKα2基因敲除（KO）小鼠各20只，各自隨機分為安靜對照組，耐力訓練組，每組10只。兩訓練組進行4周，每天1 h，速度為12 m/min的跑臺訓練，測定股四頭肌CPT-1 mRNA和蛋白表達以及血清FFA、TG水平。結果：4周耐力訓練之后，WT鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表達，與安靜對照組相比均顯著升高，且兩訓練組之間無顯著差異。結論：耐力訓練中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游調(diào)節(jié)因子，可能有其他途徑參與CPT-1表達的調(diào)節(jié)。

耐力訓練；AMPKα2；CPT-1；脂肪酸氧化

5'-腺苷酸活化的蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核生物中能量變化的感受器，AMPK在運動中被激活伴隨骨骼肌脂肪酸氧化作用的增強[1-2]。肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1）是長鏈脂肪酸進入線粒體進行脂肪酸β氧化的限速酶，在脂肪酸代謝過程中起關鍵的調(diào)控作用。多項研究[3-5]表明，耐力運動能增加CPT-1在骨骼肌中的表達。這種運動訓練后骨骼肌CPT-1表達增加是否與AMPK有關呢？因此，本研究以AMPKα2基因敲除和野生小鼠為研究對象，通過耐力訓練觀察野生和基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達以及對血甘油三酯（TG）、血游離脂肪酸（FFA）的影響，探討耐力訓練中AMPKα2調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的可能途徑。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物分組

健康兩月齡C57BL/6J野生（WT）小鼠和AMPKα2基因敲除（Knockout，KO）小鼠各20只（由Department of Endocrinology，Metabolism and Cancer， Institute Cochin， UniversitéParis Descartes，F(xiàn)rance提供兩只AMPKα2基因敲除鼠，并由中國醫(yī)學科學院動物研究所幫助保種繁殖），體重（18±2）g，根據(jù)體重隨機分為4組，每組10只：野生安靜對照組（C），野生耐力訓練組（S），基因敲除安靜對照組（CK），基因敲除耐力訓練組（SK）。

1.2 實驗動物飼養(yǎng)與運動方式

所有小鼠均在北京體育大學動物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，每籠4～5只，室內(nèi)溫度（20～25）℃，相對濕度50%～70%，每天光照12 h，自由進食，飲水，國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。兩安靜對照組小鼠不施加運動負荷，正?；\中飼養(yǎng)。兩耐力訓練組小鼠采取每天1 h，每周6天，持續(xù)4周的跑臺運動，其中第1天跑臺速度為8 m/min，第2天10 m/min，第3天達到預定強度12 m/min，并維持此強度至4周訓練結束。

1.3 取 材

最后一次訓練結束即刻開始禁食，12 h后取材。乙醚麻醉，摘除雙側眼球取眼血，后立即取雙側股四頭肌，迅速投入液氮，再轉移至-80℃冰箱保存。血樣靜置30 min，4℃離心機3 000 r/min 20 min分離血清后，存于-20℃待用。

1.4 測定方法

1.4.1 RNA與蛋白樣品的制備 （1）總mRNA的提取。取骨骼肌50～100 mg在液氮環(huán)境下研磨成粉末后移入離心管中，加1 mLTrizol勻漿，顛倒混勻15 s，冰上靜置5 min后加0.2 mL氯仿，震蕩，冰上靜置5 min后12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液（約400 μL）移入另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫下靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇（用DEPC水配制）1 mL，7 500 r/ min，4℃離心10 min，棄上清，再次用75%乙醇洗滌，棄上清，在超凈臺中晾干，溶于10 μLDEPC水。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

（2）蛋白提取。取骨骼肌100 mg在液氮環(huán)境下研磨成粉末后移入離心管中，加入蛋白裂解液（Tris-Cl、NaCl、EDTA、Tritonx-100、PMSF）1 mL勻漿，12 000 r/min，4℃離心1 h取上清。

1.4.2 指標測定方法 （1）骨骼肌AMPKα2mRNA及CPT-1mRNA表達。采用實時熒光定量（Real-time PCR）兩步法。先進行逆轉錄（RT）部分，杭州朗基科學儀器有限公司生產(chǎn)的PCR擴增儀，型號MG96+/Y，RT-PCR試劑盒由Promega公司生產(chǎn)。具體反應條件：70℃ 5 min；42℃ 1 h；70℃ 15 min。合成的cDNA于-20℃儲存?zhèn)溆谩? 300熒光定量PCR儀和熒光染料反應體系（SYBRR Green PCR Master Mix）購自美國應用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems）。引物用引物設計軟件（Primer 5）設計，并經(jīng)BLAST驗證后，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光量數(shù)值由實時定量PCR儀（StepOne實時熒光定量PCR系統(tǒng)，Applied Biosystems）讀取，目標基因表達結果以比較CT法相對定量。目標基因=2-△△CT。

表1 引物序列Table 1 Gene Primer sequences for PCR

（2）骨骼肌AMPKα2及CPT-1蛋白表達。用western blot法測定，先用考馬斯亮藍法測定總蛋白量，計算出蛋白上樣量后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出目的蛋白（AMPKα2，CPT-1）和內(nèi)參蛋白（β-actin），再轉移置硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶封閉30 min，1抗（1：1 000）4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，1×TBS洗滌一次。室溫下二抗（1：2 000）孵育1 h，1×TBST洗滌3次，1× TBS洗滌1次。AMPKα2的一抗為AMPKα2，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。CPT-1的一抗為CPT-1，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。內(nèi)參的一抗為 β-actin，mouse monoclonal IgG1，Santa Cruz Biotechnology，Inc。所有二抗均為 donkey anti-goat IgG-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Inc。曝光前加入發(fā)光液反應1 min，入暗室用X光片壓片曝光。用生物電泳圖像分析軟件（FR-980 Smart View，復日科技）拍照，最后用ImageJ軟件讀取條帶積分灰度值，結果用相對積分灰度值（目的/內(nèi)參）表示。

（3）血清甘油三酯（Triglyceride，TG）和血清游離脂肪酸（Free fatty acids，F(xiàn)FA）水平的測定，試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計算均值和標準差（平均數(shù)±標準差），統(tǒng)計方法采用雙因素方差分析，組間差異顯著性標準為P<0.05達到顯著性水平。

2 實驗結果

2.1AMPKα2mRNA表達和蛋白表達

由表2可見，經(jīng)過4周耐力訓練，野生鼠骨骼肌AMPKα2 mRNA和蛋白表達水平，與安靜對照組相比均顯著升高（P<0.05）。

Table表 2 2 Th耐e力 ef訓fec練t 對of eAnMdPurKaαnc2em trRaNinAin、y蛋 o白n 表AM達P水Kα平2的m影RN響A and protein expression （n=8）

2.2 CPT-1mRNA表達和蛋白表達

由圖1和圖2可見，4周耐力訓練之后，野生鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表達，與安靜對照組相比均顯著升高，且兩訓練組之間無顯著差異。

圖1 耐力訓練CPT-1mRNA表達的影響Figure 1 The effect of endurence training on CPT-1 mRNA expression

圖2 耐力訓練CPT-1蛋白表達的影響Figure 2 The effect of endurence training on CPT-1 Protein expression

2.3 血清TG和FFA變化

由表3可見，4周耐力訓練之后，與安靜對照組相比，野生鼠血清TG值無明顯變化，而KO鼠血清TG值顯著下降（P<0.05）。各組血清FFA之間均無顯著性差異。

Table3 Blo表od3s se各ru組m小FF鼠Aa血n清dTTGGle和velFsFinAth水ef平ou比rtr較eatmen（tmgmrooul/pLs）

3 分析討論

3.1耐力訓練對AMPKα2mRNA和蛋白表達的影響

Wojtaszewski J F等[6]讓6名健康男子以45%最大攝氧量強度進行功率自行車試驗直到力竭，測得運動中AMPKα2活性連續(xù)性升高，在力竭時達最大值。Durante P E等[7]對大鼠的研究也發(fā)現(xiàn)，7周遞增負荷跑臺訓練以后，股四頭肌AMPKα2的活性顯著升高。Fr準sig C等[8]通過人體實驗發(fā)現(xiàn)3周耐力訓練并未增加股外側肌中AMPKα2的蛋白表達，大鼠實驗也發(fā)現(xiàn)遞增負荷耐力訓練后AMPKα2活性顯著增強，但蛋白表達變化甚微[7]。本次實驗結果表明4周耐力訓練以后，野生耐力訓練組小鼠股四頭肌AMPKα2的mRNA表達水平和蛋白表達水平都明顯高于野生安靜對照組（見表2），表明該耐力訓練能夠明顯增加野生鼠骨骼肌AMPKα2mRNA和蛋白表達。

3.2 耐力訓練對CPT-1mRNA和蛋白表達的影響

Tunstall R J等[3]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)9天運動使CPT-1mRNA表達顯著增加57%（P<0.05）以及Russell A P等[4]的研究表明9周耐力訓練使CPT-1mRNA表達增加75%（P<0.01）。國內(nèi)研究也表明8周有氧運動可以明顯增加小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達[5]。從本研究結果來看，經(jīng)過4周跑臺訓練后，訓練組小鼠骨骼肌內(nèi)CPT-1mRNA和蛋白表達均明顯高于安靜對照組（見圖2，圖4），與以上研究結果相同。耐力訓練能夠增加CPT-1mRNA和蛋白表達，原因可能與脂肪酸供能特點有關，長時間、中低強度的耐力運動中，脂肪酸是提供能量的主要來源，CPT-1作為長鏈脂肪酸進入線粒體內(nèi)膜的限速酶在脂肪酸供能過程中發(fā)揮重要作用。因此每天1 h，持續(xù)4周的反復訓練可能在時間和次數(shù)上對刺激CPT-1轉錄和翻譯水平上升產(chǎn)生積累效應，造成CPT-1mRNA和蛋白表達增多。

3.3 耐力訓練對AMPKα2基因敲除鼠CPT-1表達水平及血脂的影響

CPT-1作為長鏈脂肪酸進入線粒體內(nèi)膜的限速酶，控制著長鏈脂肪酸的β氧化過程[9]。丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA，MCA）可通過抑制CPT-1活性而阻礙長鏈脂肪酸的β氧化[10-11]。體外研究發(fā)現(xiàn)5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside（AICAR）能夠激活骨骼肌中AMPK，最終減少MCA合成，并伴隨骨骼肌脂肪酸氧化作用增強[12]，提示AMPK可能通過調(diào)節(jié)CPT-1而控制骨骼肌脂肪酸氧化過程。也有動物實驗表明AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌內(nèi)CPT-1mRNA含量比正常野生鼠低26%[13]。本實驗結果顯示通過4周耐力訓練，S組CPT-1mRNA和蛋白表達較之C組分別增加1.0倍（P<0.05）和2.2倍（P<0.05），同樣，SK組CPT-1mRNA和蛋白表達比CK組增加了0.5倍（P<0.05）和1.3倍（P<0.05），表明耐力訓練中AMPKα2的敲除并沒有影響CPT-1表達水平的上升。同時，并未發(fā)現(xiàn)CPT-1mRNA和蛋白表達在兩種鼠間出現(xiàn)顯著差異。近年來研究發(fā)現(xiàn)AMPKγ3也對骨骼肌脂肪酸代謝起重要調(diào)節(jié)作用[14-15]以及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2）也參與調(diào)節(jié)運動中骨骼肌脂肪酸攝取和氧化過程。綜上所述，運動對CPT-1表達的調(diào)節(jié)是一個復雜的過程，在耐力訓練中AMPKα2可能不是CPT-1唯一調(diào)節(jié)因子，AMPKα2對CPT-1表達的影響可能被其他調(diào)節(jié)通路或機制所代償，具體機制有待進一步探討。

另外，同種基因型鼠耐力訓練前后及野生和基因敲除鼠間血清FFA無顯著性差異，推測FFA受多種因素的調(diào)節(jié)如激素leptin，因而血清中濃度相對恒定。但耐力訓練后AMPKα2基因敲除鼠SK組比CK組血清TG水平顯著下降（P<0.05），原因仍有待于進一步研究。

4結 語

4周耐力訓練，AMPKα2基因敲除和野生型小鼠股四頭肌中CPT-1mRNA和蛋白表達均顯著性升高，且兩種鼠間無顯著差異，提示耐力訓練中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游調(diào)節(jié)因子，可能有其他途徑參與CPT-1表達的調(diào)節(jié)。

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Effect of Endurance Training on Skeletal Muscle CPT-1 Expression of α2-AMPK Whole-body Knockout Mice

XIE Jin1,GONG Haojie1,ZHANG Ying2
(1.Graduate School,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Institute of Human Sports Science,Beijing Sport University,Beijing 100084,China)

Objective:To study the effect of endurance training on skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of α2-AMPK whole-body knockout (KO)mice.Meanwhile,we also explore the possible role of AMPKα2 in regulating fatty acid oxidation in endurance training.Methods:C57BL/6J wild-type (WT)mice (n=20)and α2-AMPK whole-body knockout(KO)mice (n=20),two months old,were randomly subdivided into control groups and exercise groups.Quadriceps femoris muscle was removed after 4 weeks treadmill running (12m/min,1h/day).Expression of CPT-1 mRNA and protein,blood serum FFA and TG levels were measured.Results:After 4 weeks endurance training,skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of WT and KO mice were significantly higher than control groups.At the same time,there were no significant differences between two exercise groups.Conclusion:AMPKα2 is not the only upstream regulatory factor of CPT-1 in endurance training,and there could have other factors which regulate CPT-1 mRNA and protein expression during this kind of training.

endurance training;AMPKα2;CPT-1;fatty acid oxidation

G 804.7

A

1005-0000（2010）01-0030-03

2009-12-22；

2010-01-10；錄用日期：2010-01-12

北京市自然科學基金項目（項目編號：5072031）；衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室開放課題基金（項目編號：ZDS200804）

謝 謹（1986-），女，安徽巢湖人，北京體育大學在讀碩士研究生。

1.北京體育大學研究生院，北京100084；2.北京體育大學運動人體科學學院，北京100084。