酶法提取芝麻中的短肽

劉愛文，陳曉剛，陳 忻，卜海東

(佛山科學技術學院理學院，廣東 佛山 528000)

酶法提取芝麻中的短肽

劉愛文，陳曉剛，陳 忻，卜海東

(佛山科學技術學院理學院，廣東 佛山 528000)

以黑芝麻為原料，用乙酸乙酯、異丙醇、石油醚3種溶劑脫脂，再用堿提酸沉法提取出芝麻蛋白；利用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶對其進行水解制備短肽，以水解度為考察指標優(yōu)選出最佳單酶，通過正交試驗對工藝條件進行優(yōu)化并確定最佳水解條件。結果表明：乙酸乙酯脫脂效果最好，其脫脂率達90.22%；堿性蛋白酶為最佳單酶；在底物質量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質量比(E/S)3.0%、酶解時間4.0h時水解度為24.10%，總氮回收率為78.28%，所制得短肽的平均肽鏈長度為2.93。

黑芝麻；脫脂；芝麻蛋白；酶解

Abstract：Black sesame seeds were degreased using several degreasing agents including ethyl acetate, isopropanol and petroleum ether. Sesame protein was extracted by alkali extraction and acid precipitation. The optimal single enzyme was selected by the degree of hydrolysis. The hydrolysis conditions were optimized through orthogonal experiments. Results indicated that ethyl acetate was the most effective degreasing agent with a degreasing rate of 90.22%. Alkali protease was the optimal enzyme for the hydrolysis of sesame protein. The optimal hydrolysis conditions were substrate concentration of 1.0 g/100mL, hydrolysis temperature of 40.0 ℃, hydrolysis pH of 9.0, enzyme-concentration (E/S) ratio of 3.0%, and enzymatic hydrolysis time of 4.0 h. The degree of hydrolysis of sesame protein reached up to 24.10% and the recovery rate of total nitrogen was 78.28% under the optimal hydrolysis conditions. The average length of prepared small peptides was 2.93.

Key words：black sesame；extraction；sesame protein；enzymatic hydrolysis

近10年來，國內外對生物活性肽進行了大量的基礎和應用研究，已有多肽藥物和營養(yǎng)產品推向市場，市場前景極為可觀[1]。研究表明：活性肽都以非活性狀態(tài)存在于蛋白質長鏈中，當采用適當?shù)姆椒ㄋ獾玫竭@些低肽時，其活性就釋放出來[2]；許多活性肽具有原蛋白質或其組成氨基酸所沒有的功能，它們與機體各種功能調節(jié)、疾病的發(fā)生及免疫、內分泌、衰老、代謝等有著非常密切的關系，在生命活動中起著非常重要的作用[3]。目前，我國在這方面雖已有可喜的發(fā)展，但與發(fā)達國家相比，尚有一定的差距，因此，生物活性肽的研究在我國具有較為廣泛的前景[4]。

芝麻自古以來就是我國人人皆知的高級營養(yǎng)食品。據(jù)有關資料報道，芝麻含有豐富的VA、VD、VE和優(yōu)質的蛋白質；不飽和脂肪酸、卵磷脂、谷氨酸含量很高，是天然的調味香料。芝麻具有烏須發(fā)、宜脾胃、補肝腎、生精益髓、潤腸通便、促進血液循環(huán)、益智健腦等功能。但是與其他作物相比，其還未得到充分開發(fā)利用[1,3]。

芝麻屬胡麻科(Pedaliaceae)胡麻屬(Sesamum indicumL.)，是我國四大油料之一，2000年我國芝麻產量已達81萬t[5]。芝麻中的蛋白質含量為20%～22%，芝麻蛋白質氨基酸組成與牛肉相比，除賴氨酸含量較低外，其余皆接近或達到FAO/WHO建議優(yōu)質蛋白，且富含硫氨基酸，尤其蛋氨酸含量高于其他植物蛋白[1,3]。可作為蛋白質和含硫氨基酸強化劑，以彌補大豆蛋白的不足。大量研究證實蛋白質在人體內并不是全部以單個氨基酸形式被吸收，而是以小肽、寡肽的形式被人體吸收，且這種小肽、寡肽被吸收的效果要比氨基酸好，同時這些小肽、寡肽還都具有特殊的生物活性功能。我國近幾年也開始對植物活性肽的提取和研究，一般是對大豆、豌豆、玉米等研究報道較多，但對芝麻肽的制備和研究報道還是比較少的。本實驗研究用酶解法制備芝麻活性肽，旨在為芝麻活性肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑芝麻 市購。生物酶制劑：堿性蛋白酶(20萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、菠蘿蛋白酶(20萬U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠；79-1型控溫磁力攪拌器 江蘇醫(yī)療儀器廠；800型離心沉淀器上海手術器械廠；KDN-2C 型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；FA2004N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；WH95-1多功能攪拌機 順德市白馬電器塑料廠；CS101-2E型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海訊能電熱設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芝麻脫脂

1.2.1.1 脫脂方法[6]

稱取芝麻10.00g三份，粉碎，分別用異丙醇、乙酸乙酯、石油醚浸泡，用磁力攪拌器攪拌，每30min攪拌1次，每次攪拌5min。浸泡2h，浸泡結束后傾去上清液，然后用蒸餾水把脫脂芝麻洗3遍，置于烘箱中烘干。取出一定量的脫脂芝麻，用索氏提取器繼續(xù)脫脂，稱取處理前后的質量，計算芝麻中剩余脂肪量，比較異丙醇、乙酸乙酯、石油醚的脫脂效果。選擇脫脂率最高的有機溶劑。

1.2.1.2 芝麻脂肪的測定[7]

采用快速抽提法測定芝麻脂肪含量。樣品用乙醚回流提取，使樣品中的脂肪進入溶劑中，回收溶劑后所得到的殘留物，即為粗脂肪。稱取一定量樣品于蒸發(fā)皿中，加入海砂20g，于沸水浴上蒸干后，再于95～105℃烘干、研細，全部移入濾紙筒內，蒸發(fā)皿及有樣品的玻璃棒都用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，將棉花一同放進濾紙筒內。濾紙筒放入索氏抽提器內，連接已干燥至恒質量的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無水乙醚，加至接受瓶2/3體積處，于水浴上加熱(65℃)使乙醚不斷的回流提取，至抽提完全為止。

計算方法：

式中：m1為未脫脂的粗脂肪質量/g；m2為脫脂后的粗脂肪質量/g。

1.2.2 提取芝麻蛋白的方法[8-9]

芝麻蛋白主要是堿溶性蛋白，在堿性條件下溶解度較大，所以提取基本方法是堿提酸沉法。稱取200.0g脫脂芝麻，加水[料液比為1:10(g/mL)]，攪拌均勻。加入一定量的0.5% NaOH溶液調節(jié)溶液的pH值至10.0，控制溫度在50℃，緩慢攪拌，使蛋白質在堿性狀態(tài)下溶解，一般溶解時間為4h，離心分離，得到蛋白液。取上述蛋白液調節(jié)pH值至芝麻蛋白的等電點(pH4.5左右)，靜置，沉淀，干燥得到芝麻分離蛋白。

1.2.3 酶解芝麻蛋白制備活性肽的工藝流程[10-11]

芝麻蛋白→預處理→保溫酶解→滅酶→冷卻→離心→芝麻蛋白水解液

1.2.3.1 芝麻蛋白酶解前的預處理[12]

稱取1.0g芝麻蛋白若干份，加入一定比例的水勻漿，調節(jié)適宜pH值，于恒溫水浴鍋中加熱至預設定的酶解溫度。

1.2.3.2 酶解處理[13]

待芝麻蛋白水溶液的溫度達到預設值時，加入定量的酶，置于確定溫度的恒溫水浴鍋內計時進行酶解。整個酶解過程中，需不停攪拌以保證反應充分。

1.2.3.3 滅酶處理

酶解結束后，水解液立即置于沸水浴中10min加熱滅酶，冷卻反應液于4000r/min離心10min得到芝麻蛋白水解液，測量水解上清液體積，然后冷藏保存。

1.2.4 芝麻蛋白總氮含量的測定

[14]、[15]，用半微量凱氏定氮法測定芝麻蛋白總氮含量。

1.2.5 水解液水解度、總氮回收率、平均肽鏈長度的測定

1.2.5.1 蛋白質水解物中的氮含量測定

采用半微量凱氏定氮法。取水解上清液10.0mL，放入定氮管中，加入硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、加熱消化至淡藍色，液體澄清，冷卻定容到100mL，用半微量凱氏定氮法定氮。

1.2.5.2 酶解液中游離氨態(tài)氮測定

參考文獻[16]，采用電位滴定法測定游離氨態(tài)氮含量。

1.2.5.3 水解液水解度、總氮回收率、平均肽鏈長度的計算公式

式中：L為平均肽鏈長度；m為蛋白質水解物中的氮含量/%；n為酶解液中游離氨態(tài)氮/%。

1.2.6 酶的篩選

將1.0g芝麻蛋白用水配成質量分數(shù)5%的溶液，按酶與底物質量比為2%加入堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，按擬定各酶的適宜溫度、pH值水解4h后測定水解度。

2 結果與分析

2.1 3種脫脂劑脫脂效果的比較

芝麻中脂肪的含量很高，如果酶解產物含有較多的脂肪會造成其在溫度較高時容易焦化，而且對氮含量的測定結果有一定的影響。因此，先將芝麻脫脂以供下一步提取蛋白。比較3種脫脂劑對芝麻脫脂率的影響，結果見表1、2。

表1 脫脂劑的萃取水浴溫度Table 1 Extraction temperature of different degreasing agents

表2 脫脂前后芝麻脫脂率比較Table 2 Comparison on degreasing rates of different degreasing agents

由表2可見，乙酸乙酯的脫脂效果最好，脫脂率達90.22%；其次是異丙醇脫脂，脫脂率為71.78%；石油醚脫脂率僅為70.44%。因此選用脫脂效果最好的乙酸乙酯為脫脂劑。

2.2 芝麻蛋白的提取

按1.2.2節(jié)方法，稱取脫脂芝麻200.0g，用堿提酸沉法制備出芝麻蛋白40.3g，顏色為褐色，有醇香味道。

2.3 總氮含量的測定

用半微量凱氏定氮法。兩次滴定分別消耗0.025mol/L硫酸14.30mL和14.70mL，空白實驗消耗硫酸0.20mL。計算得芝麻蛋白總氮含量為9.21%，總蛋白質含量48.81%。

2.4 酶的篩選

按1.2.6節(jié)方法對所選擇的酶進行篩選，所得結果見表3。

由表3可見，堿性蛋白酶酶解芝麻蛋白的水解度較大，這是因為芝麻蛋白在堿性溶液中的溶解性較大，從而酶能充分地和蛋白接觸進行水解。因此選擇堿性蛋白酶作為實驗用酶。

表3 不同蛋白酶水解芝麻蛋白的水解度結果Table 3 Degrees of hydrolysis for sesame protein digested by different proteases

2.5 最佳酶解條件的確定

2.5.1 堿性蛋白酶酶解芝麻蛋白酶解條件的正交試驗

表4 堿性蛋白酶水解芝麻蛋白正交試驗因素水平表Table 4 Factors and levels of sesame protein digested by alkali protease

表5 堿性蛋白酶水解芝麻蛋白正交試驗結果Table 5 Results of orthogonal experiments for the digestion of sesame protein using alkali protease

本研究選A(溫度)/℃、B(酶解時間)/h、C(pH值)、D(酶與底物質量比)/%、E底物質量濃度/(g/100mL)這5個因素，各取5個水平，以水解度為考察指標，按表4因素水平進行正交試驗，所得結果見表5。

由表5極差(R)的結果可以看出：各因素對芝麻蛋白水解度影響的主次順序為E＞A＞C＞D＞B，即對水解度影響的主次因素為底物質量濃度＞溫度＞pH值＞酶與底物質量比＞酶解時間。根據(jù)水平均值(k)可以得出最優(yōu)水平組為A1B3C4D5E1，即底物質量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質量比3.0%、酶解時間4.0h，在此條件下酶解芝麻蛋白其水解度可達24.10%。

2.5.2 各條件下的總氮回收率、平均肽鏈長度

按照式(3)、(4)計算總氮回收率和平均肽鏈長度，所得結果見表6。

表6 堿性蛋白酶在各條件下水解芝麻蛋白總氮回收率和平均肽鏈長度Table 6 Recovery rate of total nitrogen and the average length of small peptides prepared by sesame protein digestion using alkali protease at different conditions

由表6可知，實驗測得產品中總氮回收率在34.26%～97.83%，平均肽鏈長度2.36～19.75。若在表5得出的最優(yōu)水平組A1B3C4D5E1，即底物質量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質量比3.0%、酶解時間4.0h的條件下，酶解芝麻蛋白其總氮回收率為78.28%。所制得短肽的平均肽鏈長度為2.93。

3 結 論

用實驗方法比較3種有機溶劑對芝麻的脫脂效果，其中乙酸乙酯脫脂效果最好，并比較3種蛋白酶水解芝麻蛋白的效果，確定堿性蛋白酶為最佳單酶，其最佳酶解條件為底物質量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質量比3.0%、酶解時間4.0h，此時水解度最好為24.10%，總氮回收率為78.28%。所制的短肽的平均肽鏈長度為2.93。

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Extraction of Small Peptides from Sesame by Enzymatic Hydrolysis

LIU Ai-wen，CHEN Xiao-gang，CHEN Xin，BU Hai-dong
(Science School, Foshan University, Foshan 528000, China)

TQ936.16

A

1002-6630(2010)22-0145-04

2010-07-08

劉愛文(1956—)，女，高級實驗師，本科，主要從事無機化學及其相關領域研究。E-mail：annieliuaw@hotmail.com