脫脂麥胚中谷胱甘肽與麥胚蛋白提取

黃紀(jì)念，宋國輝，孫 強，詹傳保，魏 紅

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002)

脫脂麥胚中谷胱甘肽與麥胚蛋白提取

黃紀(jì)念，宋國輝，孫 強，詹傳保，魏 紅

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002)

對脫脂麥胚中谷胱甘肽(GSH)和麥胚蛋白的提取進行研究。首先采用低pH值條件從脫脂麥胚中提取谷胱甘肽，并采用超濾將該提取液中的谷胱甘肽與蛋白質(zhì)進行分離。再對提取過GSH后的麥胚殘渣中的蛋白質(zhì)進行堿提研究。最后合并超濾分離出的蛋白質(zhì)與堿提蛋白質(zhì)，采用等電點沉淀法對麥胚蛋白進行純化制備。采用單因素試驗結(jié)合正交試驗分別對GSH和麥胚蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，并最終確定GSH最佳提取工藝為提取pH6.3、提取時間15min、固液比1:13(g/mL)、提取溫度55℃，GSH的得率和提取率分別為0.31%和72.1%。麥胚蛋白的最佳提取工藝為提取pH10.5、提取溫度65℃、固液比1:11、提取時間60min。提取蛋白質(zhì)相對于堿提用沉淀的得率為39.2%，提取率為90.4%。相對于總麥胚得率為20.8%，提取率為58.8%。合并超濾截留液與堿提離心上清液，確定沉淀蛋白質(zhì)最佳pH4.2，蛋白質(zhì)沉淀率為97.5%，所得蛋白質(zhì)含量達85.2%，相對于脫脂麥胚中總蛋白質(zhì)提取率為81.1%。

脫脂麥胚；谷胱甘肽；麥胚蛋白；提??；等電點沉淀

Abstract：In this paper, the extraction and separation of glutathione (GSH) and wheat germ protein from defatted wheat germ was investigated. Glutathione was extracted from defatted wheat germ under the low pH condition. Glutathione and wheat germ protein in extract were separated by ultra-filtration method. The protein residue after GSH extraction was subjected to further alkali extraction. The obtained protein was purified by isoelectric precipitation method. The extraction conditions for GSH were optimized by single factor and orthogonal experiments to be material-liquid ratio of 1:13, pH of 6.3, extraction temperature of 55 ℃ and extraction time of 15 min. Under the optimal extraction conditions, the yield and extraction rate of GSH was up to 0.31% and 72.1%. The extraction conditions for wheat germ protein were optimized by single factor and orthogonal experiments to be material-liquid ratio of 1:11, pH of 10.5, extraction temperature of 65 ℃ and extraction time of 60 min. Under the optimal extraction conditions, the yield and extraction rate of protein was up to 39.2% and 90.4% based on the amount of alkali extraction precipitate. The yield and extraction rate of protein were 20.8% and 58.8% based on the amount of defatted wheat germ. The ultra-filtration liquid and supernatant after alkali precipitation was combined. The optimum pH for precipitating protein from combined solution was 4.2. The precipitation rate and yield of protein were 97.5% and 85.2%. After the combination, the extraction rate of protein was 81.1% based on the amount of deffated wheat germ.

Key words：defatted wheat germ；reduced glutathione；wheat germ protein；extraction；isoelectric precipitation

小麥胚芽是小麥面粉加工的副產(chǎn)物，占小麥籽粒的2%～3%，在小麥制粉中合理的工藝可提取0.3%～0.5%(以小麥計)[1]。我國小麥年產(chǎn)量為1億t左右[2]，88%用于加工面粉時[3]，可以得到小麥胚芽26～44萬t。小麥胚芽含有極其豐富且優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂肪、多種維生素、礦物質(zhì)及一些尚未解明的微量生理活性組分，被營養(yǎng)學(xué)家們譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”[4]。其中蛋白質(zhì)含量約為30%～35%，其是一種完全蛋白質(zhì)，氨基酸全面平衡，是一種天然的優(yōu)質(zhì)食品蛋白和氨基酸強化劑。且可用作食品生產(chǎn)中的功能性配料，能改善某些食品的結(jié)構(gòu)與口感[5]。此外，小麥胚芽中GSH含量高達0.465%[6]，其是一種具有重要生理功能的活性三肽，具有抗氧化、清除自由基、解毒、增強免疫力、延緩衰老、抗癌、抗放射線危害等功能，是重要的功能因子，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用非常廣泛[7]。由此可見，小麥胚芽具有極大的應(yīng)用開發(fā)價值。但我國對小麥胚芽資源的利用層次卻較低，目前對小麥胚芽的利用主要在3個方面[8]：第一，大部分小麥胚芽被混入麩皮中當(dāng)作飼料來用，造成資源的極大浪費；第二，直接加到食品中。比如麥胚烘烤食品、湯料、休閑小食品等；第三，提取小麥胚芽油，但脫脂后的小麥胚芽又被當(dāng)作飼料廉價出售，小麥胚芽這一寶貴資源沒有得到充分合理的利用。目前對小麥胚芽中谷胱甘肽及麥胚蛋白的開發(fā)利用報道[9-13]，僅限于單一的谷胱甘肽或麥胚蛋白，而同時對谷胱甘肽和麥胚蛋白進行開發(fā)利用還未見報道。因此，從取油后的脫脂麥胚中同時開發(fā)谷胱甘肽和麥胚蛋白，可以更充分的挖掘小麥胚芽的潛在價值，延長小麥加工產(chǎn)業(yè)鏈，促進小麥經(jīng)濟發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

脫脂麥胚(經(jīng)檢測谷胱甘肽含量為0.413%，蛋白質(zhì)含量為35.4%，小麥胚芽由鄭州精深糧食工程器械有限公司提供，經(jīng)本實驗室超臨界CO2萃取脫脂)；谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DTNB Alfa Aesar公司。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司； UV2802型紫外-可見分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司；飛鴿牌DB-L-2型低速大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；DELTA 320型pH計Mettler Toledo公司；ZDDN-2型全自動凱氏定氮儀 杭州托普科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GSH提取與麥胚蛋白制備工藝流程

1.2.2 GSH含量測定

GSH的測定采用DTNB法[14-15]。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

GSH含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻[15]方法并稍作改進。配制濃度為0.0005mol/L的谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、0.4、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1mL依次加入到7支10mL具塞刻度試管中，依次加超純水至0.5mL，再分別加入2.5mL DTNB分析液[DTNB分析液由pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液將0.01mol/L DTNB(由0.05mol/L CH3COONa配制)溶液稀釋100倍所得]，再加入2.0mL pH8.0的Tris-HCl緩沖溶液，25℃反應(yīng)10min，在412nm波長處測吸光度，不加GSH作對照，繪制吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)擬合曲線方程為：y=1151.3x－0.0071，R2=0.9993。

1.2.2.2 樣品中GSH的測定

用0.5mL待測樣品替代GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他所加試劑及操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制測定方法相同。樣品中以Tris-HCl緩沖液代替顯色劑DTNB作為參比，測定樣品中GSH含量。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定

蛋白質(zhì)含量測定采用微量凱氏定氮法[16]，蛋白質(zhì)換算系數(shù)采用6.25。

1.2.4 GSH的提取及提取率測定

以20g脫脂麥胚為原料，水為提取溶劑，在一定的pH值、提取溫度、固液比和提取時間條件下對GSH進行提取。提取結(jié)束后，自來水冷卻10min，5000r/min離心55min，測量上清液體積，測定上清液中GSH含量，計算提取率。提取率按下式計算：

提取率/%=上清液中GSH總量/脫脂麥胚原料中GSH總量×100

1.2.5 蛋白質(zhì)提取及提取率測定

以提取GSH后的離心沉淀為原料，在一定的堿性pH值、提取溫度、固液比(相對于未初始未提GSH的麥胚)及提取時間條件下對麥胚蛋白進行提取。提取結(jié)束后自來水冷卻10min，5000r/min離心30min，稱量上清液體積，測定蛋白質(zhì)含量，計算提取率。提取率按下式計算：

1.2.6 超濾

GSH提取離心上清液經(jīng)0.45μm微孔過濾后，采用Millipore實驗級切向超濾系統(tǒng)，膜截留分子量為5000進行超濾，循環(huán)濃縮至截留液體積為初始體積的1/10。

1.2.7 蛋白質(zhì)酸沉pH值確定[17]

以一定濃度的蛋白質(zhì)溶液為研究對象，用2mol/L HCl調(diào)不同pH值，5000r/min離心10min，測定上清液中蛋白質(zhì)含量，其中蛋白質(zhì)含量最低的pH值為最佳酸沉pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH提取研究

2.1.1 提取pH值對GSH提取率的影響

圖1 提取pH值對GSH提取率的影響Fig.1 Effect of pH on extraction rate of GSH

固液比1:13(g/mL)、時間30min、溫度50℃，pH值分別為3、4、5、6.3、7.4、8進行GSH提取。如圖1所示，pH6.3時GSH的提取效果最好。GSH提取率在pH值大于7以后，急劇下降，在pH8.0時幾乎沒有GSH存在，與文獻報道GSH在堿性條件下不穩(wěn)定[9]相一致。

2.1.2 提取溫度對GSH提取率的影響

圖2 提取溫度對GSH提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of GSH

提取pH6.3、固液比1:13(g/mL)、提取時間30min，提取溫度分別為40、50、60、70、80、90、100℃進行提取。如圖2所示，在50℃時提取率最高，之后隨著溫度的升高，GSH提取率迅速下降，在80℃達到最低點，隨后又開始上升。50℃以后，GSH提取率降低可能與溫度升高造成淀粉糊化、蛋白變性，從而阻礙了GSH的溶出有關(guān)。

2.1.3 固液比對GSH提取率的影響

提取pH6.3、提取溫度50℃、提取時間30min，固液比分別為1:7、1:10、1:13、1:16、1:19(g/mL)進行提取。如圖3所示。固液比為1:10(g/mL)時，GSH提取率最高，隨著液體量的增大，GSH提取率有所降低。但不同固液比之間GSH提取率差別不大。

圖3 固液比對GSH提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of GSH

2.1.4 提取時間對GSH提取率的影響

圖4 提取時間對GSH提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of GSH

提取pH6.3、固液比1:13(g/mL)、提取溫度50℃，提取時間分別為10、15、20、25、30、35、40min進行提取。如圖4所示。提取時間為15min時，GSH提取率最高，隨后GSH提取率隨時間的延長逐漸降低。這可能是因為在提取過程中存在兩個變化過程，一個是GSH從麥胚中溶出，另一個是GSH本身在實驗溫度下會有一定的損失。在10～15min過程中，GSH從麥胚中溶出的速度大于GSH損失的速度。在達到15min后，麥胚中的GSH大部分已經(jīng)溶出，繼續(xù)從麥胚溶出的速度降低，而GSH的損失速度則占據(jù)優(yōu)勢，因此，GSH提取率隨時間的延長而逐漸下降。

2.1.5 GSH提取正交試驗

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing the extraction of GSH

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取最優(yōu)pH6.3，采用L9(3)3正交試驗對影響水提GSH的主要因素進行研究和分析，以GSH提取率作為考察指標(biāo)，以確定最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗因素水平表見表1，試驗結(jié)果極差分析見表2。

表2 正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for optimizing the extraction of GSH

由表2極差分析可知，在提取pH6.3的條件下，3個因素對GSH提取率的影響強弱順序為C＞B＞A，提取時間對GSH提取率影響最大，其次是固液比，最后是提取溫度。最佳工藝條件為C1B3A3，即提取時間15min、固液比1:13(g/mL)、提取溫度55℃。以最佳工藝條件進行GSH提取，GSH得率為0.31%，提取率為72.1%。

2.2 超濾初步分離提取液中GSH與蛋白質(zhì)

采用2.1.5節(jié)中得出的最佳工藝條件進行GSH提取，所得離心上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.24%(相對于固形物)，相對于脫脂麥胚得率為12.3%，提取率為34.7%。采用超濾對其所含的GSH與蛋白質(zhì)進行分離，GSH及蛋白質(zhì)分離結(jié)果見表3。由表可以看出，經(jīng)超濾后谷胱甘肽的含量雖然提高不大，但卻與蛋白質(zhì)得到了良好分離。截留液中蛋白質(zhì)的含量提高將近1倍，且具有較高的回收率，說明大部分大分子蛋白質(zhì)被截留。經(jīng)計算超濾截留液中蛋白質(zhì)相對于脫脂麥胚得率為8.63%，提取率為24.4%。透過液中谷胱甘肽的含量雖然提高不大，但卻與大部分蛋白質(zhì)得到分離，為其下一步采用離子交換等其他方式純化打下了基礎(chǔ)。

2.3 麥胚GSH提取殘渣中蛋白質(zhì)提取研究

脫脂麥胚經(jīng)2.1.5節(jié)中優(yōu)化的最佳GSH提取工藝提取離心后，其離心沉淀經(jīng)干燥后質(zhì)量為10.6g，經(jīng)檢測含蛋白質(zhì)4.6g，即含有43.4%的蛋白質(zhì)(干基計)，具有較大的進一步利用價值，有必要進行蛋白質(zhì)提取制備研究。

2.3.1 pH值對蛋白質(zhì)提取的影響

固液比1:9(g/mL)、溫度45℃、提取時間1h，2mol/L NaOH溶液控制pH值分別為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5進行單因素研究，結(jié)果如圖5所示。蛋白質(zhì)提取率著pH值的升高而不斷增加，但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在pH10.5～11時，需加入堿的量明顯增加，而要將pH值控制到11.5則需要另加入更多量的堿液，且提取液黏度大，顏色深，澄清度差，含雜質(zhì)多，不利于下一步的純化，因此pH值不宜高于10.5。

圖5 提取pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of pH on extraction rate of defatted wheat germ protein

2.3.2 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響

2mol/L NaOH溶液控制pH9.0、溫度45℃、固液比1:9(g/mL)，作不同時間的單因素研究。如圖6所示，在實驗條件下，提取60min時蛋白質(zhì)提取率最高，其他時間結(jié)果相差不大。這可能與提取過程中存在蛋白的溶出與變性兩個過程有關(guān)，60min以前蛋白提取的溶出速度大于變性速度，之后隨著原料中蛋白含量的降低，蛋白溶出的速度低于變性速度，從而導(dǎo)致蛋白提取率又有所降低。

表3 超濾分離GSH提取液中GSH與蛋白質(zhì)結(jié)果Table 3 Separation between GSH and protein in extract by ultra-filtration method %

圖6 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of defatted wheat germ protein

2.3.3 提取溫度對蛋白質(zhì)提取的影響

圖7 提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on extraction rate of defatted wheat germ protein

固液比1:9(g/mL)、提取時間60min、2mol/L NaOH溶液控制pH9.0，作30、40、45、50、55、60、65℃溫度單因素試驗，結(jié)果見圖7。蛋白質(zhì)提取率隨溫度的升高而不斷升高，60℃時達到最高值，之后在65℃又有所降低。這可能是由于隨溫度的升高，蛋白分子的運動速度逐漸增大，提取率不斷升高，60℃之后，蛋白又有部分變性導(dǎo)致提取率降低。

2.3.4 固液比對蛋白質(zhì)提取的影響

圖8 固液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.8 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of defatted wheat germ protein

提取溫度45℃、時間60min、2mol/L NaOH溶液控制pH9.0，在固液比(以原麥胚20g計)1:5、1:7、1:9、1:11、1:13、1:15(g/mL)條件下進行單因素試驗，結(jié)果見圖8。固液比為1:11(g/mL)時，蛋白質(zhì)提取率最高，其次是1:13(g/mL)和1:15(g/mL)。這可能與當(dāng)液體量過小時，物料黏度大，溶質(zhì)的溶出阻力增強，導(dǎo)致蛋白提取率較低。而當(dāng)液體量過大時，物料濃度過低，蛋白溶出阻力雖然減小，但分子自由程增大，分子間碰撞機會減少，物料內(nèi)蛋白釋放程度減弱，蛋白提取率也較低。

2.3.5 正交試驗優(yōu)化堿提工藝

正交試驗研究因素及水平見表4，結(jié)果及極差分析見表5。

表4 蛋白質(zhì)提取正交試驗因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing the extraction of defatted wheat germ protein

表5 蛋白質(zhì)提取正交試驗結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for optimizing the extraction of defatted wheat germ protein

由表5極差分析可知，4個因素對蛋白質(zhì)提取率的影響強弱順序為B＞A＞D＞C，即pH值對蛋白質(zhì)提取率的影響最大，其次是溫度，然后是固液比，最后是提取時間。最佳工藝條件為B3A3D2C2。最終確定堿提蛋白質(zhì)工藝為提取pH10.5、提取溫度65℃、固液比1:11(g/mL)、提取時間60min。在此條件下進行蛋白質(zhì)提取工藝驗證，計算所得蛋白質(zhì)相對于堿提用沉淀的得率為39.2%，提取率為90.4%。相對于總麥胚得率為20.8%，提取率為58.8%。

2.4 蛋白質(zhì)純化研究

2.4.1 蛋白質(zhì)酸沉pH值初步選擇

合并超濾截留液與堿提離心上清液，所得混合液中蛋白質(zhì)含量相對于原料脫脂麥胚為29.43%，提取率為83.1%。分別取該蛋白質(zhì)溶液50mL，用2mol/L HCl溶液調(diào)pH3.0、4.0、5.0、6.0.進行酸沉pH值初步選擇，其結(jié)果見表6。由表6可以看出，pH4.0、5.0時，離心上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度相對較低，最佳酸沉pH值可能在此區(qū)間。因此，在初步確定了范圍后，從pH3.6開始，以0.2為梯度，直至pH5.4進行等電點的精確選擇。

表6 不同沉淀pH值條件下上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Table 6 Protein content in supernatant during acid precipitation process under different pH conditions

2.4.2 酸沉pH值精確選擇

將2.4.1節(jié)中所用蛋白質(zhì)混合液減壓濃縮至原來體積的1/2，然后分別取此濃縮液30mL于離心管中，分別調(diào)pH3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4，5000r/min離心10min，凱氏定氮法測上清液中蛋白質(zhì)總量。結(jié)果見表7，由表7可知，堿提蛋白質(zhì)的酸沉pH4.2時，上清液中蛋白質(zhì)含量最少，相應(yīng)的蛋白質(zhì)沉淀率也最高。由此確定酸沉等電點pI=4.2，蛋白質(zhì)沉淀率達97.5%，經(jīng)測定所得沉淀中蛋白質(zhì)含量達85.2%。最終所得蛋白質(zhì)相對于脫脂麥胚得率為28.7%，提取率為81.1%。

表7 不同酸沉pH值條件下蛋白質(zhì)濃縮液離心后上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量Table 7 Protein mass in supernatant during acid precipitation process under different pH conditions

3 討論與結(jié)論

谷胱甘肽屬于酸性肽，在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下極不穩(wěn)定[9]。而麥胚蛋白的制備一般采用堿提酸沉的方法[12-13]，若先進行蛋白質(zhì)的提取，勢必會使GSH在堿性條件下?lián)p失殆盡。GSH的提取文獻上的報道大都在較高的溫度[9-10](≥80℃)，這又會使蛋白在高溫條件下變性，都不能滿足GSH和蛋白質(zhì)的同時得到利用。本研究在較低溫度(55℃左右)下，pH6.3的條件下先進行以GSH提取為主要目的提取工藝優(yōu)化，采用超濾的方法使提取液中GSH與蛋白質(zhì)初步分離。GSH提取后的沉淀殘渣中仍含有大量蛋白質(zhì)，又采用堿提的方法最大限度地對其進行提取。最后將超濾分離出GSH后的截留蛋白質(zhì)溶液與堿提蛋白質(zhì)溶液混合，采用酸沉的方法進行純化。整個工藝提取條件溫和，溫度不超過65℃。蛋白質(zhì)與谷胱甘肽得到了良好的分離，所得蛋白質(zhì)具有較高的純度及提取率，分別達85.2%和81.1%，從而最終實現(xiàn)了GSH和蛋白質(zhì)的同步提取、充分綜合利用。

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Extraction of Glutathione and Wheat Germ Protein from Defatted Wheat Germ

HUANG Ji-nian，SONG Guo-hui，SUN Qiang，ZHAN Chuan-bao，WEI Hong
(Institute of Agricultural Products Processing, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China)

TS210.9

A

1002-6630(2010)22-0139-06

2010-06-30

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研發(fā)展專項

黃紀(jì)念(1971—)，男，副研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品精深加工與功能食品開發(fā)。E-mail：hjinian@sina.com