藍(lán)莓多糖超聲波提取及脫蛋白方法

孫希云，劉 寧，孟憲軍,*，朱金艷，劉曉晶

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161)

藍(lán)莓多糖超聲波提取及脫蛋白方法

孫希云1，劉 寧2，孟憲軍1,*，朱金艷1，劉曉晶1

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161)

采用超聲波法輔助提取藍(lán)莓中多糖。通過(guò)正交試驗(yàn)分析，得到了粗多糖提取的最佳工藝條件：提取時(shí)間40min，提取溫度50℃，超聲波功率80W；在此條件下，藍(lán)莓鮮果多糖的得率為2.335%。比較了3種脫蛋白的方法，結(jié)果表明酶解和三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合法蛋白脫除率較高，可達(dá)95.32%，多糖的保留也較好，接近80%，并且操作方便簡(jiǎn)單，是較好的脫蛋白方法。

藍(lán)莓；多糖；超聲波提取；脫蛋白

Abstract：Ultrasonic treatment was used to extract polysaccharides from blueberry. The optimal extraction processing parameters were optimized by orthogonal experiments to be extraction time of 40 min, extraction temperature of 50 ℃ and ultrasonic power of 80 W. Under the optimal extraction conditions, the yield of polysaccharides from blueberry was 2.34%. Three methods for removing protein from crude polysaccharides extracted from blueberry were compared. Results indicated that the combinatorial method between enzymatic hydrolysis and trichloroacetic acid-n-butanol was better than the single method for protein removal rate of 95.32%. In contrast, the retention rate of polysaccharides was more than 80%. The method was simple and suitable to remove protein in polysaccharides from blueberry.

Key words：blueberry；polysaccharide；ultrasound-assisted extraction；protein removal

藍(lán)莓(Blueberry)，又名越橘、藍(lán)漿果，屬杜鵑花科(Efica ce a e)越桔亞科(Va cc inioid ea e)越桔屬(Vacciniodeae)植物，為多年生落葉或常綠灌木或小灌木，主要分布在北美和歐洲。該屬植物在全世界有450種[1]。我國(guó)已知有91種28個(gè)變種，南北方均有分布，但主要分布區(qū)是西南、華南及東北地區(qū)。藍(lán)莓果實(shí)含有防止腦神經(jīng)衰老、增強(qiáng)心臟功能、明目及抗癌等獨(dú)特功效物質(zhì)[2-7]，因此被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類(lèi)五大健康食品之一[8]。鑒于此，近些年來(lái)，藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展在國(guó)內(nèi)外都迅速崛起，特別是國(guó)內(nèi)的適宜栽種區(qū)更是掀起了對(duì)藍(lán)莓研究的熱潮，在藍(lán)莓的引種栽培、果實(shí)加工方面都做了較多的工作[9-10]。但與國(guó)外相比，其功能性成分方面的研究還相對(duì)較少，也未見(jiàn)有突出的研究成果，特別是對(duì)于藍(lán)莓果中活性成分——多糖的研究還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在以超聲波法提取藍(lán)莓中多糖，并篩選出較適宜的脫蛋白的方法，為其純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生理功能方面的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓(品種為藍(lán)豐) 遼寧藍(lán)金實(shí)業(yè)有限公司；牛血清蛋白 北京奧博星生物試劑公司；考馬斯亮藍(lán)G-250(Fluka) 上海化學(xué)試劑公司；葡萄糖、濃硫酸、苯酚(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵 上海華琦科學(xué)儀器有限公司；TDL-5000B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF6050真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；粉碎機(jī) 上海世邦有限公司；數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-250A型超聲波反應(yīng)器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量測(cè)定[11]

采用硫酸-苯酚法，準(zhǔn)確稱取105℃烘干至質(zhì)量恒定的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖25.0mg于250mL容量瓶中，加水至刻度并搖勻，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加水補(bǔ)至1.0mL，然后加入5%苯酚1.6mL及濃硫酸7.0mL，充分搖勻，室溫放置25min以后于波長(zhǎng)490nm處測(cè)吸光度，以蒸餾水按同樣顯色操作為空白，以多糖質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程。

精確吸取多糖樣品溶液1.0mL，加入5%苯酚1.6mL及濃硫酸7.0mL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線之操作，測(cè)定吸光度。將其代入回歸方程，即可得多糖的含量，計(jì)算得率。

1.3.2 超聲波輔助提取藍(lán)莓多糖[12-15]

1.3.2.1 提取工藝

稱取干燥至質(zhì)量恒定的60℃條件下粉碎(100目)篩的藍(lán)莓10g，溶于60mL蒸餾水中，不同超聲功率、超聲時(shí)間，超聲溫度處理，并不斷攪拌，取出后再以3000r/min離心10min，棄去下層不溶物，取上清液，加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，冰箱中靜置過(guò)夜，取出，以3000r/min離心10min，取沉淀，先后用丙酮、乙醚、乙醇沖洗抽濾，真空干燥得粗多糖。

1.3.2.2 單因素試驗(yàn)

選取超聲波對(duì)多糖提取有顯著影響的三項(xiàng)因素，分別采用時(shí)間20、40、60、80min 4個(gè)水平；溫度30、40、50、60℃ 4個(gè)水平，功率40、60、80、90W 4個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，做L9(33)正交試驗(yàn)，因素水平范圍如下：時(shí)間(A)分別為20、40、60min；溫度(B)分別為40、50、60℃；時(shí)間(C)分別為40、60、80W。得出超聲波輔助提取多糖的最佳工藝條件。

1.3.3 粗多糖脫蛋白方法[16-18]

1.3.3.1 牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

考馬斯亮藍(lán)試劑的配制：將考馬斯亮藍(lán)G-2500.1g溶于50mL的95%乙醇，加入10mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000mL，濾紙過(guò)濾，最終試劑含0.01(g/100mL)考馬斯亮藍(lán)G-250。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：將0.1g牛血清蛋白溶于100mL蒸餾水中，得標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支試管，分別加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，加水至2mL；取8支試管，0號(hào)管加入0.1mL蒸餾水，1～7號(hào)管依次加入0.1mL上一步驟所配的標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋液，然后各加入5mL蛋白質(zhì)染色劑，充分振蕩混合，2min后于595nm測(cè)定吸光度；以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線作為定量的依據(jù)。

1.3.3.2 Sevag法脫蛋白

配制一定質(zhì)量濃度粗多糖溶液，加入其體積1/3的氯仿-正丁醇(4:1)溶液，振蕩30min，經(jīng)離心去除沉淀后，取少量水相測(cè)蛋白質(zhì)含量，然后將水相再加入其體積1/3的氯仿-正丁醇溶液，重復(fù)若干次。

1.3.3.3 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白

三氯乙酸-正丁醇(1:10，V/V)與一定質(zhì)量濃度的藍(lán)莓多糖液等體積混合，振蕩10min，靜置1h，重復(fù)3次。

1.3.3.4 酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合脫蛋白

酶法與三氯乙酸-正丁醇法相結(jié)合使用脫蛋白，重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.1節(jié)方法，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=6.8369x+0.0897，r=0.9990。

2.2 超聲波輔助提取藍(lán)莓多糖

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 超聲波提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖得率的影響

在超聲波功率40W、溫度40℃、料水比1:60(g/mL)的條件下，探索提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓多糖提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲波提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of polysaccharides from blueberry

由圖1可知，隨溫度升高，多糖提取率快速提高，超聲波提取時(shí)間為40min時(shí)，提取效果達(dá)到最高，但當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，提取率反而下降，這可能是由于超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械切力作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使大分子多糖斷裂，并在后處理過(guò)程中損失，從而影響多糖的提取率的增加量，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，超聲作用時(shí)間適宜選擇在40min左右。

2.2.1.2 超聲波提取溫度對(duì)藍(lán)莓多糖得率的影響

在超聲波功率40W、提取時(shí)間40min、料水比1:60(g/mL)的條件下，探索溫度對(duì)藍(lán)莓多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 水浴溫度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from blueberry

由圖2可知，隨著溫度升高，多糖得率不斷增加，但50℃以后，溫度再升高，多糖得率變化不明顯，考慮到節(jié)省資源，選擇溫度為50℃。

2.2.1.3 超聲波提取功率對(duì)藍(lán)莓多糖得率的影響

利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)、強(qiáng)烈空化效應(yīng)以及高速攪拌作用都可以加快植物的有效成分進(jìn)入溶劑，在溫度50℃，提取時(shí)間40min、料水比1:60(g/mL)的條件下，結(jié)果見(jiàn)圖3，隨著超聲波功率的增加，多糖得率逐漸增大，但超聲波功率大于80W后，吸光度增加很少，考慮到經(jīng)濟(jì)性和超聲波功率過(guò)高可能使多糖降解，降低多糖活性，選擇超聲波功率為80W。

圖3 超聲波功率對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides from blueberry

2.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定因素水平范圍，正交試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

從正交試驗(yàn)和方差分析可以看出：RC＞RB＞RA，說(shuō)明超聲波功率對(duì)多糖得率的影響最為顯著，其次是提取溫度和提取時(shí)間。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳工藝條件為A2B2C3，即提取時(shí)間40min、提取溫度50℃、超聲波功率80W，藍(lán)莓多糖得率為2.335%。

表1 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

表2 藍(lán)莓多糖得率方差分析Table 2 Variance analysis for extraction rate of polysaccharides from blueberry

2.3 脫蛋白方法的研究

2.3.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

圖4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of protein determination

試驗(yàn)得出的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程為：y=0.00829x－0.0569，R2=0.9942。由圖4可知，粗多糖中蛋白質(zhì)的含量為36.36%。

2.3.2 Sevag法脫蛋白

圖5 Sevag法對(duì)蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.5 Protein removal effect by Sevag method

藍(lán)莓粗多糖經(jīng)過(guò)20次Sevag法脫蛋白處理，結(jié)果見(jiàn)圖5，蛋白質(zhì)含量隨著脫蛋白次數(shù)的增加而減少。在前15次減少的幅度很大，蛋白脫除率達(dá)85%，之后變化不大。

2.3.3 三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白

圖6 三氯乙酸-正丁醇法對(duì)蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.6 Effect of trichloroacetic acid-n-butanol method on protein removal from polysaccharides

由圖6可見(jiàn)，三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白效果要比Sevag法效果明顯，經(jīng)過(guò)3次脫蛋白后可脫去85.31%的蛋白質(zhì)，之后增加脫除次數(shù)，脫除率沒(méi)有較大變化，可能是因?yàn)橛行┑鞍诪榻Y(jié)合蛋白，與多糖結(jié)合在一起，采用三氯乙酸-正丁醇法無(wú)法去除。

2.3.4 酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合脫蛋白

圖7 酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.7 Effect of the combinatorial treatment between enzymatic method and trichloroacetic acid-n-butanol method on protein removal from polysaccharides

由圖7可知，酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合蛋白脫除率比單純用三氯乙酸-正丁醇法要高很多。即酶解處理后，再經(jīng)三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白，重復(fù)處理4次，此時(shí)蛋白質(zhì)脫率可達(dá)95.32%，此方法可較大程度去除粗多糖中的雜蛋白，起到純化多糖的作用，并且簡(jiǎn)單易行。

2.3.5 3種脫蛋白方法多糖損失比較

圖8 3種脫蛋白方法多糖損失比較Fig.8 Comparision on the loss of polysaccharides bu protein removal using three different methods

由圖8可以看出，同樣脫除4次，Sevag法和三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白多糖保留率相似，都低于70%；而酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合脫蛋白多糖的保留率較前兩者都高，將近80%。在考慮脫蛋白的效果，酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合脫蛋白4次后蛋白脫除率已達(dá)95.32%，較前兩者也高出了不少。

3 結(jié) 論

超聲波提取多糖單向試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的分析結(jié)果可以看出，超聲波功率對(duì)多糖得率的影響最為顯著，其次是提取溫度和提取時(shí)間。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳工藝條件：提取時(shí)間40min、提取溫度50℃、超聲波功率80W，藍(lán)莓多糖的得率為2.335%。

將Sevag法、三氯乙酸-正丁醇法、酶解和三氯乙酸-正丁醇法聯(lián)用分別應(yīng)用于除去藍(lán)莓多糖提取液中的蛋白，結(jié)果表明酶解和三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合法蛋白脫除率較高95.32%，而前兩者為85%、85.31%。并且操作方便簡(jiǎn)單，除此之外，酶法與三氯乙酸-正丁醇法結(jié)合脫蛋白多糖的保留率較前兩者都高，將近80%，是脫蛋白的較好方法。

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Ultrasonic Extraction and Protein Removal of Polysaccharides from Blueberry

SUN Xi-yun1，LIU Ning2，MENG Xian-jun1,*，ZHU Jin-yan1，LIU Xiao-jing1
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China；2. College of Land and Environmental Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

TQ929.2

A

1002-6630(2010)22-0134-05

2010-02-02

遼寧省科技廳項(xiàng)目(1102-01082609001)

孫希云(1978—)，女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)楣呱锘钚猿煞?。E-mail：sun_xiyun@163.com

*通信作者：孟憲軍(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸ぁ-mail：mengxjsy@126.com