平菇菌絲體多糖的分離純化和體外抗氧化活性

曹向宇，劉劍利*，蘆秀麗，婁 虹，霍雅鵬

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

平菇菌絲體多糖的分離純化和體外抗氧化活性

曹向宇，劉劍利*，蘆秀麗，婁 虹，霍雅鵬

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

采用酶法提取平菇菌絲體多糖，通過L9(34)正交試驗(yàn)考察加酶量、溫度、時(shí)間、pH值對(duì)平菇菌絲體多糖提取率的影響，確定其最佳提取條件；通過DEAE-32離子交換層析和Sephadex G100凝膠過濾純化平菇菌絲體多糖，DPPH自由基清除作用測(cè)定抗氧化活性，紫外光譜掃描和薄膜電泳方法鑒定多糖的純度；利用化學(xué)比色法檢測(cè)其對(duì)O2－·和·OH的清除能力和對(duì)小鼠紅細(xì)胞溶血抑制程度。結(jié)果表明：平菇菌絲體多糖最佳提取條件為加酶量1.0%、溫度55℃、時(shí)間2h、pH5.3，最佳條件下多糖提取率為(4.91±0.15)%；純化后的多糖能清除O2－·和·OH及抑制紅細(xì)胞溶血的生成，且呈現(xiàn)一定劑量關(guān)系。表明平菇菌絲體多糖在一定濃度范圍內(nèi)具有體外抗氧化作用。

平菇菌絲體；多糖；純化；抗氧化

Abstract：Crude polysaccharides were extracted fromPleurotus ostreatusmycelium by cellulase. Optimal extraction conditions were explored to evaluate the effects of enzyme dosage, extraction temperature, extraction time and pH on extraction rate of polysaccharides through orthogonal experiments. Crude polysaccharides were purified with DEAE-32 and Sephadex G100 column chromatography. The purity of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium was determined by UV scanning and cellulose acetate electrophoresis. Antioxidant activity of polysccharides was evaluated by the scavenging capability of surperoxide anion and hydroxyl free radicals and the inhibition rate of erythrocyte hemolysis. Results indicated that the optimal extraction conditions for preparing polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium by cellulase were enzyme dosage of 1.0%,extraction temperature of 55 ℃, extraction time of 2 h and pH 5.3. The extraction rate was up to (4.91±0.15)% under the optimal extraction conditions. The purified polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium revealed antioxidant activity such as scavenging capability of free radicals and suppression of erythrocyte hemolysis in a dosage-dependent manner. Therefore, the polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium have strong antioxidant activity in vitro in a certain concentration range.

Key words：Pleurotus ostreatusmycelium；polysaccharides；purification；antioxidation

平菇(Pleurotus ostreatus)又名側(cè)耳、蠔菇、黑牡丹菇、秀珍菇，屬于擔(dān)子菌門、傘菌目、側(cè)耳科，是目前我國栽培廣泛的食用菌之一。平菇含豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，改善人體的新陳代謝，調(diào)節(jié)植物神經(jīng)，減少血清膽固醇、降低血壓和防治肝炎、胃潰瘍等功效[1]。

近年來，開發(fā)與利用真菌多糖作為保健食品和藥品已逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。真菌多糖不僅具有抗氧化、抗病毒、抑菌、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫力等多種生物活性，而且具有良好的藥理和臨床利用價(jià)值[2-6]。目前食藥用真菌多糖主要是從子實(shí)體中獲得，但子實(shí)體栽培周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大，受氣候、環(huán)境的影響嚴(yán)重，而菌絲體具有生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵步驟簡(jiǎn)單、產(chǎn)量大、易于控制等優(yōu)點(diǎn)，從菌絲體中提取多糖可以縮短生產(chǎn)時(shí)間、提高生產(chǎn)效率，便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。目前國內(nèi)對(duì)平菇研究主要集中于在選育、栽培和增產(chǎn)方面[7-10]，子實(shí)體多糖提取也有研究[11-12]，但平菇菌絲體多糖提取、純化及生物活性研究未見報(bào)道。本研究即以平菇菌絲體為原料，優(yōu)化平菇菌絲體多糖的提取方法，對(duì)菌絲體多糖進(jìn)行純化和抗氧化活性分析，以期為平菇資源的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平菇(Pleurotus ostreatus)菌種(北平11) 遼寧大學(xué)生命科學(xué)院保藏；昆明種小鼠 中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT) 前進(jìn)化學(xué)試劑廠；核黃素 上海和逸化工有限公司；纖維素酶(6萬U/g)、二苯基苦味肼基(DPPH)、Sephadex G100 Sigma公司；DEAE-32纖維素 Whatman公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SCR 20BC型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；UV-1100紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DYY-5型電泳儀 北京六一儀器廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體多糖提取工藝流程

菌種→菌種活化→搖瓶培養(yǎng)→離心(3000r/min，10min)收集沉淀→菌絲體→烘干→粉碎→過篩(80目)→酶法提取多糖→離心→上清液得到粗多糖溶液→乙醇沉淀多糖→Sevag法除蛋白→硫酸-蒽酮法測(cè)多糖含量→離子交換層析→凝膠過濾→純度鑒定→抗氧化活性分析

1.3.2 菌種活化和搖瓶培養(yǎng)[7]

1.3.2.1 菌種活化

將平菇菌種轉(zhuǎn)接在PDA斜面培養(yǎng)基上，于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。

1.3.2.2 一級(jí)搖瓶培養(yǎng)

可溶性淀粉培養(yǎng)基，裝液量150/500mL，高壓常規(guī)滅菌后，每瓶接種約1cm2的活化菌種3塊，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h后，置于25℃，以160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d。

1.3.2.3 二級(jí)搖瓶培養(yǎng)

二級(jí)搖瓶培養(yǎng)基，裝液量200/500mL，接種量8%，160r/min，25℃搖床振蕩培養(yǎng)6d。

1.3.3 平菇菌絲體多糖提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[13]

根據(jù)表1，以料液比1:60加水后進(jìn)行平菇菌絲體多糖提取的正交試驗(yàn)L9(34)，優(yōu)化平菇菌絲體多糖提取條件，其中，料液比(g/g)＝菌絲體干質(zhì)量/水質(zhì)量。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

1.3.4 多糖含量測(cè)定及多糖提取率計(jì)算

硫酸-蒽酮比色法測(cè)定多糖含量[14]。

1.3.5 平菇菌絲體多糖純化

1.3.5.1 DEAE-32離子交換層析純化多糖

將正交試驗(yàn)制備的粗多糖(質(zhì)量濃度達(dá)到50mg/mL)溶解后進(jìn)行DEAE-32離子交換柱(2.6cm×50cm)層析純化粗多糖，上樣體積8mL，以0～1.0mol/L NaCl梯度洗脫(2mL/管)，硫酸-蒽酮法檢測(cè)多糖，收集單一峰，蒸餾水透析48h，冷凍干燥，檢測(cè)各組分對(duì)DPPH自由基的清除作用，鑒定各峰抗氧化活性[15]。

1.3.5.2 Sephadex G100凝膠過濾純化多糖

DEAE-32離子交換層析純化后收集具有較高抗氧化活性的單一峰(多糖質(zhì)量濃度20mg/mL)，進(jìn)一步分離純化，Sephadex G100凝膠過濾(2.6cm×70cm)[15]，上樣體積1mL，蒸餾水洗脫(2mL/管)，硫酸-蒽酮法檢測(cè)多糖，收集單一峰，蒸餾水透析48h，冷凍干燥，檢測(cè)各組分對(duì)DPPH自由基的清除作用，鑒定各峰抗氧化活性[16]。

1.3.6 平菇菌絲體多糖純度鑒定

1.3.6.1 紫外光譜掃描[17]

經(jīng)層析分離后的多糖，在200～350nm波段進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.6.2 醋酸纖維素薄膜法[18]

收集經(jīng)層析分離后的多糖，將醋酸纖維素薄膜在巴比妥緩沖液中浸泡1h，濾紙吸干液體，點(diǎn)樣后在20V電泳30min。電泳后用甲苯胺藍(lán)染液染色，0.5%的冰醋酸溶液脫色，結(jié)果照相分析。

1.3.7 平菇菌絲體多糖體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)[19]

大量收集DEAE-32離子交換層析和Sephadex G100凝膠過濾分離純化后的對(duì)DPPH自由基清除率最高的平菇菌絲體多糖，進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.7.1 清除自由基能力測(cè)定

配制0.1～0.5mg/mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，NBT法測(cè)定清除能力[20]；脫氧核糖法測(cè)定清除·OH能力[21]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.7.2 H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血實(shí)驗(yàn)

依文獻(xiàn)[22]方法操作，制備0.5%紅細(xì)胞懸液，配制0.1～0.5mg/mL不同質(zhì)量濃度多糖溶液，測(cè)定OD415，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，計(jì)算紅細(xì)胞溶血抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇菌絲體多糖提取優(yōu)化試驗(yàn)

按照表2進(jìn)行平菇菌絲體多糖提取優(yōu)化試驗(yàn)并計(jì)算多糖提取率。

表2 平菇菌絲體多糖提取L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

由表2可得，影響平菇菌絲體多糖提取的因素影響大小順序?yàn)榧用噶浚緶囟龋緯r(shí)間＞pH值。通過正交試驗(yàn)確定平菇菌絲體多糖最佳提取條件為加酶量1.0%、溫度55℃、時(shí)間2h、pH5.3，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，平菇菌絲體多糖提取率為(4.91±0.15)%。

2.2 平菇菌絲體多糖分離純化

2.2.1 DEAE-32離子交換層析

由圖1可得，平菇菌絲體多糖分離得到3個(gè)主要組分，在相同質(zhì)量濃度下，分別進(jìn)行DPPH自由基清除能力檢測(cè)，各峰組分對(duì)DPPH自由基清除率分別為(11.25±0.09)%、(45.23±0.18)%、(3.16±0.05)%，故收集峰2組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

圖1 平菇菌絲體多糖的DEAE-32洗脫曲線Fig.1 Elution profile of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium through DEAE-32 chromatography

2.2.2 SephadexG100凝膠過濾

圖2 平菇菌絲體多糖的Sephadex G100洗脫曲線Fig.2 Elution profile of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium through Sephadex G100 chromatography

由圖2可得，平菇菌絲體多糖分離得到2個(gè)主要峰，在相同質(zhì)量濃度下，分別進(jìn)行DPPH自由基清除能力檢測(cè)，各峰組分對(duì)DPPH自由基清除率分別為(61.16±0.15)%、(13.78±0.20)%，故大量收集峰1組分，進(jìn)行純度鑒定。

2.3 平菇菌絲體多糖純度鑒定

2.3.1 紫外光譜掃描

圖3 平菇菌絲體多糖的紫外光譜Fig.3 UV-visible spectrum of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

由圖3可知，平菇菌絲體多糖僅在200nm波長(zhǎng)處顯示多糖吸收峰，在波長(zhǎng)260nm和280nm沒有明顯的吸收峰，表明此多糖基本無蛋白和核酸雜質(zhì)存在。

2.3.2 醋酸纖維素薄膜電泳

將經(jīng)過2種層析后分離得到的平菇菌絲體多糖，進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)。所得到的條帶見圖4，也證明了平菇菌絲體中含有1種多糖，達(dá)到了電泳純。

圖4 平菇菌絲體多糖的醋酸纖維素薄膜電泳圖Fig.4 Cellulose acetate electrophoresis of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

2.4 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 抗自由基能力測(cè)定

圖5 平菇菌絲體多糖清除自由基能力Fig.5 Scavenging capability of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium on free radicals

2.4.2 平菇菌絲體多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血實(shí)驗(yàn)的抑制作用

圖6 平菇菌絲體多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血的影響Fig.6 Effect of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium on erythrocyte hemolysis induced by H2O2

如圖6所示，0.1～0.5mg/mL的平菇菌絲體多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血都有抑制作用，且表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。表明平菇菌絲體多糖能明顯抑制溶血反應(yīng)的發(fā)生，有效保護(hù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。

3 結(jié) 論

3.1 通過酶法L9(34)正交試驗(yàn)確定平菇菌絲多糖最佳提取條件，影響平菇菌絲體多糖提取的因素影響大小順序?yàn)榧用噶浚緶囟龋緯r(shí)間＞pH值。最佳提取條件為加酶量1.0%、溫度55℃、時(shí)間2h、pH5.3，平菇菌絲體多糖提取率為(4.91±0.15)%。

3.2 通過DEAE-32離子交換層析和Sephadex G100凝膠過濾分離純化平菇菌絲體多糖，收集抗氧化活性最高峰，其對(duì)DPPH自由基清除率為(61.16±0.15)%。

3.3 紫外光譜掃描和醋酸纖維素薄電泳對(duì)層析得到的多糖進(jìn)行純度鑒定，電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到單一條帶，證明該平菇菌絲體多糖為均一組分，并且不含有蛋白質(zhì)、多肽及核酸成分。

3.4 經(jīng)分離后的0.1～0.5mg/mL平菇菌絲體多糖對(duì)O－2·和·OH都有較好的清除效果，并對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血都有抑制作用，且表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，說明該平菇菌絲體多糖具有較高的體外抗氧化活性。

3.5 對(duì)平菇菌絲體多糖的分離、純化及體外抗氧化活性分析，為平菇的深加工和保健食品的開發(fā)利用上提供了基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)，有關(guān)平菇菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)信息和生物學(xué)活性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Purification and Antioxidant Activity of Polysaccharides fromPleurotus ostreatusMycelium

CAO Xiang-yu，LIU Jian-li*，LU Xiu-li，LOU Hong，HUO Ya-peng
(School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Q939.9

A

1002-6630(2010)22-0124-05

2010-08-01

遼寧省教育廳高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2009A811； L20100154)；遼寧省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2009209001)；遼寧大學(xué)“211工程”三期建設(shè)項(xiàng)目

曹向宇(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：xiangyucao@yahoo.cn

*通信作者：劉劍利(1980—)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：jianliliu@yahoo.com.cn