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    魚糜凝膠形成過程中物理化學變化

    2010-10-19 05:26:46汪之和施文正
    食品科學 2010年17期
    關鍵詞:魚糜二硫鍵作用力

    李 杰,汪之和*,施文正

    (上海海洋大學食品學院,上海 201306)

    魚糜凝膠形成過程中物理化學變化

    李 杰,汪之和*,施文正

    (上海海洋大學食品學院,上海 201306)

    采用化學法測定魚糜凝膠形成過程中離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的變化,借助拉曼光譜儀分析草魚魚糜凝膠形成過程中魚糜蛋白質構象的變化,進而研究化學作用力和蛋白質構象對魚糜凝膠形成的影響。結果表明:在草魚魚糜凝膠的形成過程中,離子鍵、氫鍵顯著減少,疏水相互作用、二硫鍵和非二硫共價鍵增加;α-螺旋結構部分轉化為無規(guī)卷曲結構。疏水相互作用、二硫鍵及非二硫共價鍵是影響凝膠形成的主要作用力,α-螺旋和無規(guī)卷曲是草魚魚糜凝膠形成過程中維持魚糜凝膠穩(wěn)定結構的主要蛋白質構象。

    魚糜凝膠;化學作用力;蛋白質構象;機理

    Abstract:Fresh water fish surimi products processing is one of the main directions of fisheries processing industry in China.Gelation is the most important factor that affects the quality of surimi products. So making the mechanism of gel formation clear is of great significance. In the present study, chemical methods were used to determine the changes in ion, disulfide and hydrogen bonds and hydrophobic interactions during the formation of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) surimi gels and the technique used to analyze protein conformation changes was laser-Ramman spectroscopy. Furthermore, the effects of chemical forces and protein conformation on the formation of surimi gels were elucidated. The results illustrated that during surimi gel formation, ion bonds and hydrogen bonds decreased significantly. However, hydrophobic interactions, disulfide bonds and non-disulfinde covalent bonds increased markedly. Theα-helix of protein conformation was change into turn and random coil structures in part. Based on these results, it can be concluded that hydrophobic interactions, disulfide bonds and non-disulfide covalent bonds are the main chemical forces affecting the formation of surimi gels from frozen grass carp and thatα-helix and random coil structures are the main protein conformations keeping the structure of frozen grass carp surimi gels stable.

    Key words:surimi gel;chemical force;protein conformation;mechanism

    近年來,國內外研究學者普遍認為中國淡水魚魚糜制品加工是水產加工業(yè)發(fā)展的重要方向之一[1]。草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類,對草魚魚糜蛋白質結構與凝膠特性的研究可為其他淡水魚魚糜制品的研究提供一定的理論依據。凝膠特性是魚糜制品最重要的功能特性。魚糜制品的彈性是硬度、伸縮性以及黏度的綜合體現,主要取決于魚糜中蛋白質的凝膠情況[2]。魚糜中肌球蛋白的凝膠過程是影響魚糜制品的關鍵,蛋白質構象的變化決定魚糜凝膠特性[3]。因此,研究魚糜及蛋白質構象在凝膠形成過程中的變化和規(guī)律,對進一步闡明魚糜蛋白質凝膠形成的機理,具有重要的意義,并可為生產優(yōu)質魚糜制品提供基礎理論依據[4]。國內外對魚糜凝膠特性的研究比較多,但是對其凝膠形成機理的研究較少[5-10]。

    天然肌肉蛋白的構象是通過氫鍵、二硫鍵、離子鍵、疏水鍵相互作用、范德華力等化學作用力來維持的[11]。上述化學作用力在肌原纖維蛋白凝膠結構中發(fā)揮不同的作用。因此研究魚糜凝膠形成過程中化學作用力的變化可為魚糜凝膠形成機理奠定理論基礎。激光拉曼光譜是研究蛋白質構象的重要手段[12]。拉曼光譜不僅能得到有關氨基酸組成的信息,還能進一步得到某些二級結構如α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲方面的信息,對分子振動具有指紋式的分辨率,是研究魚糜凝膠中蛋白質構象的一種較為有效的技術。因此,本研究擬在測定魚糜凝膠過程當中化學作用力變化的基礎上,用拉曼光譜技術測定凝膠過程中魚糜蛋白質結構的變化,來研究化學作用力和蛋白質構象對魚糜凝膠形成的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鮮活草魚:于2010年4月購自上海南匯水產品市場。平均體質量(3500±150)g。

    尿素、β-巰基乙醇 國藥集團化學試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷 上海西寶生物科技有限公司;以上試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    SC-15數控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技有限公司;HSS型電熱恒溫水槽 重慶四達科技有限公司;EL204電子天平、FE20 pH計 Mettler Toledo公司;渦旋混合儀 上海滬西分析儀器廠;UV2100紫外分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;LabRam-1 B型顯微激光拉曼光譜儀 法國 JY公司。

    1.3 方法

    1.3.1 魚糜的制備

    鮮活草魚→去鱗、內臟、頭、尾→清洗→采肉→斬碎→漂洗(4倍于魚糜質量的清水,漂洗4次,水溫不高于10℃)→擠壓脫水→魚糜→添加抗凍劑(4%山梨醇、4%蔗糖和0.3%多聚磷酸鹽) →密封分裝,-20℃冷藏備用

    1.3.2 凝膠化魚糜和魚糜凝膠的制備

    已制備的冷凍魚糜經自然解凍,空擂2min后加入質量分數2.5%食鹽進行鹽擂10min,灌入腸衣,于40℃加熱60min后制得凝膠化魚糜,再于90℃加熱30min,流水下冷卻制得魚糜凝膠,儲藏于4℃冰箱中備用。

    1.3.3 化學作用力的測定

    參考 Gómez-Guillén 等[13]的方法。

    1.3.4 凝膠溶解率的測定

    參考 Benjakul等[14]的方法,略有改動。取1g魚糜凝膠樣品,加入20mL 20mmol/L Tris-HCl緩沖液[(含1g/100mL SDS,8mol/L尿素和體積分數2%β-巰基乙醇,pH 8.0]并均質,混合物于100℃加熱2min后,于室溫攪拌4h,10000r/min 離心30min。取上清液10mL,添加50g/100mL的冷三氯乙酸(TCA)至終質量分數為10g/100mL,混合液于4℃放置18h,10000r/min離心30min,沉淀物用10g/100mL TCA沖洗并溶解于0.5mol/L NaOH溶液中??偟鞍缀繛槟z直接溶解于0.5mol/L NaOH溶液中測得的蛋白質含量。蛋白質含量用Lowry法測定。溶解率表示為溶解于溶劑中的蛋白質占總蛋白含量的百分比。

    1.3.5 顯微激光拉曼光譜的測定

    激光光源為氬離子激光器。激光波長514nm,功率為10mW,采集時間為10s,掃描次數為40次,分辨率約1.2cm-1,拉曼位移范圍200~3999cm-1。

    2 結果與分析

    2.1 化學作用力的變化

    圖1 新鮮草魚魚糜及冷凍草魚魚糜凝膠形成過程中化學作用力的變化Fig.1 Changes of chemical forces during the formation of grass carp surimi gels and surimi

    維持蛋白質三維網絡結構的作用力包括氫鍵、疏水相互作用、離子鍵和二硫鍵。由圖1可知,新鮮制備的草魚魚糜經凍藏后,離子鍵和氫鍵顯著下降,而疏水相互作用和二硫鍵增加。魚肉蛋白在凍藏中,由于鏈的展開變性,原先位于分子內部的一些疏水性氨基酸暴露在蛋白質分子的表面,從而使蛋白質的表面疏水性發(fā)生變化[15]。魚糜中水分形成冰晶,肌原纖維蛋白空間結構發(fā)生改變,使埋藏在分子內部的巰基暴露出來,進而被氧化成二硫鍵,因此二硫鍵增多。二硫鍵也對經冷凍儲藏魚糜凝膠的形成及其強度起著非常重要的作用。在肌肉蛋白質中,巰基影響三磷酸腺苷(ATP)酶的活性,參與肌肉收縮。

    在魚糜的凝膠形成過程當中,離子鍵、氫鍵呈下降趨勢,疏水相互作用和二硫鍵呈現上升趨勢。陰陽離子通過靜電相互作用形成的離子鍵通常在蛋白質聚集過程當中表現為相互排斥力,特別是在體系中僅含有一種蛋白質或含有相似等電點(pI)的不同種蛋白質的情況下。處于等電點時蛋白質的靜電荷為零,當環(huán)境的pH值接近pI時,蛋白質分子快速隨機的聚集,易形成凝結塊。當體系pH 值處于pI和極端pH值的中間區(qū)域時,靜電排斥力和疏水相互作用很好的平衡,從而形成凝膠網絡。魚糜受熱時包埋的非極性多肽暴露出來,從而增強了鄰近多肽非極性片段的疏水相互作用。因而疏水性影響凝膠的形成過程。

    2.2 凝膠溶解率的變化

    圖2 新鮮草魚魚糜及冷凍草魚魚糜凝膠形成過程中溶解率的變化Fig.2 Changes of solubility during the formation of grass carp surimi gels and surimi

    魚糜凝膠溶解率的高低可以反應形成非二硫共價鍵的多少。內源性轉谷氨酰胺酶(TGase)普遍存在于魚體中,可催化肌球蛋白重鏈交聯形成非二硫共價鍵[16]。而含SDS、尿素和β-巰基乙醇的混合溶劑能夠斷裂魚糜凝膠中除了非二硫共價鍵外所有化學鍵。由圖2可知,凝膠化魚糜與魚糜凝膠的溶解率具有不同程度的降低,說明凝膠形成過程中形成了非二硫共價鍵。由此可知,非二硫共價鍵也是參與魚糜凝膠網絡結構形成的主要作用力之一。

    2.3 蛋白質構象的變化

    在魚糜凝膠形成過程當中,蛋白質的拉曼光譜變化如圖3、4所示。

    圖3 草魚魚糜、凝膠化魚糜和魚糜凝膠的400~2000cm-1顯微激光拉曼光譜Fig.3 Raman spectra of grass carp surimi, suwari and surimi gels in the wavenumber range from 400 to 2000 cm-1

    拉曼(Raman)光譜是研究物質結構的重要手段之一,拉曼散射是光散射現象的一種。單色光束的光子與分子相互作用時可發(fā)生彈性碰撞和非彈性碰撞。在非彈性碰撞過程中,光子與分子之間發(fā)生能量交換,從而改變光子的頻率。拉曼光譜是研究分子振動和轉動的分子光譜。任何物質都有確定的分子結構,也都有自己獨特的拉曼光譜[12]。生物大分子的拉曼光譜可得到許多結構方面的信息。蛋白質沿主鏈的肽基團—C(O)—N(H)—可能與遠側的,也可能與鄰近的肽基團—C(O)—N(N)—形成氫鍵。側鏈相互作用和主鏈氫鍵形成的結果,使多肽和蛋白質有確定的二級結構,如α-螺旋、平行或反平行的β-折疊結構、γ-轉折和無規(guī)卷曲[17]。

    圖4 草魚魚糜、凝膠化魚糜和魚糜凝膠的2000~3600cm-1顯微激光拉曼光譜Fig.4 Raman spectra of grass carp surimi, suwari and surimi gels in the wavenumber range from 2000 to 3600 cm-1

    在酰胺基團的振動中,酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的拉曼光譜峰對蛋白質主鏈構象的變化有著最為顯著的敏感性。在α-螺旋蛋白質結構中,這兩個峰值通常可在1645~1655cm-1和1260~1300cm-1范圍內找到。前者主要來源于C=O伸縮模,同時也有CN伸縮模的少量貢獻。當從α-螺旋形式向β-折疊轉變時,這兩個峰分別偏移向1665~1680cm-1和1230~1245cm-1范圍[12]。如若蛋白質是不規(guī)則的或無序形式,則酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ峰將出現在1655~1665cm-1和1245~1270cm-1范圍。由圖3可知,魚糜和凝膠化魚糜在AmideⅠ區(qū)域譜帶,魚糜蛋白出現在1651cm-1和1654cm-1,表明主要存在α-螺旋結構,而魚糜凝膠在1657cm-1出現無規(guī)則卷曲特征譜帶,表明魚糜蛋白的α-螺旋結構變成了無規(guī)則卷曲。酰胺Ⅲ區(qū)中,魚糜蛋白在1265cm-1出現α-螺旋特征峰,凝膠化魚糜和魚糜凝膠除了保持α-螺旋的特征譜帶外,還在1267cm-1分別出現了反應無規(guī)則卷曲的特征峰,進一步說明凝膠過程中魚糜蛋白的α-螺旋結構轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲。在凝膠形成過程中未見β-折疊的特征譜帶出現。以上分析表明,魚糜凝膠的形成過程當中,蛋白質二級結構的變化主要表現在α-螺旋變?yōu)闊o規(guī)卷曲結構,從而有益于蛋白質分子間的聚集和相互作用。

    拉曼光譜中,二硫鍵是CC—SS—CC中的S—S鍵,它的伸縮振動頻率是C—S鍵和C—C鍵的內旋轉的函數,二硫鍵對其所處的環(huán)境十分敏感。480~550cm-1,是蛋白質和多肽S—S鍵的伸縮振動模式。將位于500~510cm-1處歸屬為扭式-扭式-扭式(g-g-g)模式,515~525cm-1處歸屬為扭式-扭式-反式(g-g-t)模式,535~545cm-1處歸屬為反式-扭式-反式(t-g-t)模式。由圖3可知,魚糜中二硫鍵特征譜帶很弱,凝膠后增強,表明凝膠化過程中形成了二硫鍵。與凝膠過程中化學作用力的變化分析結果一致。

    830cm-1和850cm-1附近的費米共振雙峰為肌球蛋白側鏈酪氨酸殘基的譜圖,雙峰反映的是酪氨酸對羥苯基環(huán)的振動,其受環(huán)境和氫鍵中酚羥基的影響。 峰強度比值可判明酪氨酸在蛋白質分子中所處的狀態(tài)[18]。當兩者的強度比≥1時,說明酪氨酸殘基在肌球蛋白分子表面暴露的程度相對比較大,易通過氫鍵和溶劑水分子發(fā)生相互作用;當兩者的強度比小于0.3時,酪氨酸殘基在肌球蛋白分子表面暴露的程度增加,也易于與水分子形成氫鍵;而當兩者強度比在0.7~1.0時,則可認為酪氨酸殘基包埋在肌球蛋白分子內部。由圖3可知,生魚糜在830cm-1和850cm-1附近現酪氨酸殘基的雙峰,強度比為0.98,說明酪氨酸殘基位于分子內部;經凝膠化后,雙峰出現在838cm-1和859cm-1附近,強度比為1.04,表明凝膠化后酪氨酸殘基暴露于分子表面。此變化表明,凝膠形成過程中,α-螺旋解旋,蛋白質伸展導致魚糜蛋白疏水相互作用增強。

    1424cm-1是賴氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸的特征頻率;1402cm-1是天門冬氨酸和谷氨酸COO—的振動頻率。2500~3200cm-1附近的圖譜主要來自芳香族和芳香族殘基的C—H伸縮振動。由圖4可知,三者C—H伸縮振動均出現在2932cm-1處,顯示飽和脂肪族的特征。

    由以上分析可知,凝膠形成過程當中,魚糜蛋白的α-螺旋部分轉變?yōu)闊o規(guī)卷曲,將引起維持蛋白質α-螺旋結構的主要化學作用力氫鍵的斷裂,蛋白質伸展,使之在凝膠形成過程中氫鍵減少,同時疏水基團暴露,使疏水相互作用增強。巰基在加熱過程中被氧化成二硫鍵。

    3 討 論

    3.1 化學作用力對草魚魚糜凝膠形成的影響

    在魚糜的凝膠形成過程中,離子鍵、氫鍵呈下降趨勢,疏水相互作用和二硫鍵在凝膠化階段呈現上升趨勢。以往有學者認為離子鍵和氫鍵是凝膠形成和維持凝膠網絡結構的重要作用力。但本實驗結果表明,在凝膠形成過程當中,離子鍵和氫鍵顯著下降。由此可見,離子鍵和氫鍵不是維持魚糜凝膠穩(wěn)定結構的主要化學作用力。魚糜受熱時包埋的非極性多肽暴露出來,從而增強了鄰近多肽非極性片段的疏水相互作用。因而疏水性應該影響凝膠的形成過程。二硫鍵也對經冷凍儲藏魚糜凝膠的形成及其強度起著非常重要的作用。非二硫共價鍵也是參與魚糜凝膠網絡結構形成的主要作用力之一。

    3.2 魚糜蛋白質二級結構對魚糜凝膠形成的影響

    在魚糜的凝膠形成過程當中,蛋白質二級結構的變化主要表現在α-螺旋變?yōu)闊o規(guī)卷曲結構。此前也有報道觀測到α-螺旋結構減少而β-折疊結構增加的現象。Brouraoui等[19]最先借助拉曼光譜分析魚肌肉蛋白結構的變化,提出蛋白質凝膠時α-螺旋結構減少而β-折疊結構增加。如果二級結構完全破壞,蛋白質表現為隨機卷曲的行為,并且形成凝膠的能力也喪失。這種結果可能與魚種類有直接關系,有待進一步研究。

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    Changes in Chemical Forces and Protein Conformations during the Formation of Grass Carp Surimi Gels

    LI Jie,WANG Zhi-he*,SHI Wen-zheng
    (College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

    S986.1

    A

    1002-6630(2010)17-0103-04

    2010-05-09

    上海市農委項目(滬農技服字2005第9-2號)

    李杰(1985—),女,碩士研究生,研究方向為水產品加工。E-mail:sh0438203@yahoo.com.cn

    *通信作者:汪之和(1958—),男,教授,碩士,研究方向為水產品貯藏與加工。E-mail:zhwang@shou.edu.cn

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