桑葉多糖的組成及結(jié)構(gòu)表征

羅晶潔，曹學麗*

(北京工商大學化學與環(huán)境工程學院，北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048)

桑葉多糖的組成及結(jié)構(gòu)表征

羅晶潔，曹學麗*

(北京工商大學化學與環(huán)境工程學院，北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京 100048)

利用高效凝膠色譜(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)分析桑葉多糖兩個組分MPL1和MPL2的重均分子質(zhì)量分別為11800D和7630D，利用GC分析MPL1和MPL2是由D-果糖(D-Flu)、L-阿拉伯糖(L-Ara)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-木糖(D-Xyl)和D-葡萄糖(D-Glu)5種單糖組成，其物質(zhì)的量比分別為58:9.9:5.8:5.1:21.2和45:6.74:17.2:7.3:24.1。而通過高碘酸氧化和Smith降解反應的方法得到MPL1和MPL2的主鏈是由1→3位鍵合的糖基組成，支鏈為1→2位鍵合的糖基組成。紅外光譜分析桑葉多糖中存在α構(gòu)型的C—H吸收峰。

桑葉多糖；高效凝膠色譜；結(jié)構(gòu)表征；鏈接方式

Abstract：In the present study, we characterized the composition and structural attributes of two polysaccharide fractions(named MPL1 and MPL2) in mulberry leaves obtained after microwave-assisted extraction and Sephadex G50 purification. The HPGPC analysis showed that the weight-average molecular weights of MPL1 and MPL2 were 11800 D and 7630 D, respectively.According to the GC analysis, both polysaccharide fractions were composed of five monosaccharide, namelyD-Flu,L-Ara,L-Rha,D-Xyl andD-Glu, and their molar ratio was 58:9.9:5.8:5.1:21.2 for MPL1 and 45:6.74:17.2:7.3:24.1 for MPL2. By using the classic methods of periodate oxidation and Smith Degradation reaction, both the backbones of MPL1 and MPL2 were found to consist of 1→3 glycosyl bonds and the side chains consisted of 1→2 glycosyl bonds. C－H absorption peak ofαconfiguration was contained in both polysaccharide fractions according to the IR analysis.

Key words：mulberry leaf polysaccharides；HPGPC；characterization；link mode

桑葉異名鐵扇子，為?？浦参锷５母稍锶~[1]，具有疏散風熱、清肝明目、清肺潤燥等功效[2]，可用于風熱感冒、頭暈頭痛、肺熱燥咳、目赤昏花[3]。國內(nèi)外研究表明，桑葉在調(diào)控血糖、防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有明顯的功效[4-6]。桑葉的這些保健功能，多糖在其中起到了相當重要的作用[7-8]。目前國內(nèi)外對桑葉多糖的研究進展，大多是在桑葉多糖的提取和功效方面有一定的研究[9-11]，但鑒于桑葉種類的多樣性和多糖結(jié)構(gòu)的復雜性，對其結(jié)構(gòu)的研究則主要集中在一級結(jié)構(gòu)的組成和鏈接方式上面[12-14]。

本實驗利用微波輔助水提取得到桑葉粗多糖，再經(jīng)過Sephadex-G50分離純化得到兩個不同分子質(zhì)量的桑葉純多糖MPL1和MPL2，通過HPGPC、GC、IR以及經(jīng)典的高碘酸氧化和Smith降解反應對桑葉多糖的分子質(zhì)量和一級結(jié)構(gòu)進行了表征，以期為今后研究其分子修飾和構(gòu)效關(guān)系提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉多糖 自制；碘酸鈉、高碘酸鈉、乙二醇天津光復精細化工研究所；鹽酸羥胺 北京紅星化工廠；醋酸酐、吡啶、丙三醇 北京化工廠；各種單糖標樣(D-Xyl、L-Ara、L-Rha、D-Flu、D-Glu、DMan、D-Gal) 北京拜爾迪生物公司；Sephadex-G50 美國法瑪西亞公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax 190型酶標儀 美國MDS公司；Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；Agilent 6890N型氣相色譜儀 美國Agilent公司；LC-20AD型泵、CTO-20A柱溫箱 日本島津公司；DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度散射檢測器、Optilab rex示差檢測器 美國Wyatt公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉多糖的dn/dc值及其重均分子質(zhì)量的測定

dn/dc是衡量生物大分子在不同溶液中的一個技術(shù)參數(shù)，它具體是指其在溶液中的折光率隨著濃度變化的比值，從這個值可以大致的判斷大分子的種類。另外，dn/dc值是激光散射法測定重均分子質(zhì)量一個必不可少的參數(shù)，它的大小將會直接影響到分子質(zhì)量的大小。dn/dc值的測定方法：分別配制5個不同濃度梯度的桑葉多糖樣品，利用示差檢測器測定dn/dc值。

分子質(zhì)量測定方法：利用HPGPC檢測。色譜條件：色譜柱：Shodex SB-803(300mm×8mm)；流動相：0.1mol/L的NaCl溶液，流速0.5mL/min；柱溫箱溫度：40℃，進樣體積200μL；檢測器：多角度激光散射檢測器和示差檢測器。

1.3.2 桑葉多糖的單糖組成分析

水解：將桑葉多糖MPL1和MPL2溶解于2mol/L三氟乙酸(TFA)10mL，于110℃水解2h后，減壓蒸干。加適量甲醇，減壓蒸干，重復兩次以除盡三氟乙酸TFA，置真空干燥箱減壓干燥過夜。

乙酰化：將水解后的產(chǎn)物和各種單糖標樣(D-Xyl、L-Ara、L-Rha、D-Flu、D-Glu、D-Man、D-Gal)加無水吡啶1.0mL，無水醋酸酐1.0mL，封管后置于100℃水浴反應60min，減壓蒸干，加0.5mL氯仿溶解，進行氣相色譜分析。

色譜條件：色譜柱：Agilent HP-5(30m×0.32mm)；進樣口溫度：250℃；檢測器：FID；檢測器溫度：250℃；升溫程序：初溫50℃，20℃/min升溫到190℃，3℃/min，升溫到250℃；載氣：N2，流速：1.0mL/min。

1.3.3 桑葉多糖鏈接方式的確定

1.3.3.1 高碘酸氧化

高碘酸鈉消耗量標準曲線的制作：將0.15mo1/L的高碘酸鈉和碘酸鈉溶液以不同比例混合，取混合液0.4mL置于100mL容量瓶中用水稀釋至刻度，在波長223nm處測定吸光度[15]，以高碘酸的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到高碘酸鈉消耗量的標準曲線。

稱取桑葉多糖MPL1和MPL2各30mg，置于250mL棕色瓶中，加入0.015mol/L NaIO460mL，加塞置于4℃冰箱黑暗處氧化，每隔一定時間取樣，每次取樣0.2mL并用水稀釋至50mL，再測定波長223nm處吸光度，直至吸光度基本穩(wěn)定。通過標準曲線計算每摩爾糖基消耗的高碘酸摩爾數(shù)，同時取樣5.0mL，加2滴乙二醇，放置20min，以酚酞為指示劑，用0.0086mol/L NaOH標準液滴定甲酸的生成量。

1.3.3.2 Smith降解反應

經(jīng)高碘酸氧化后的多糖溶液，加入乙二醇4mL，攪拌30min終止反應。去離子水透析48h，減壓濃縮至小體積。加入100mg NaBH4，暗處放置24h。調(diào)節(jié)反應液pH值至5.5左右，透析除去過量的NaBH4，冷凍干燥得到多糖醇產(chǎn)物[15]。將多糖醇產(chǎn)物采用1.3.2節(jié)的方法進行氣相色譜分析。

1.3.4 桑葉多糖的紅外圖譜分析

將桑葉多糖MPL1和MPL2，經(jīng)過KBr壓片，用紅外光譜儀掃描得到紅外圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉多糖的dn/dc值及分子質(zhì)量的測定

將桑葉多糖配制成1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2mg/mL的溶液，示差檢測器檢測，如圖1所示。以圖1中各個臺階信號強度的大小為縱坐標，每個臺階對應的質(zhì)量濃度為橫坐標，描點作圖，并線性回歸，所得斜率即為dn/dc值，即圖2所示。結(jié)果表明：桑葉多糖的dn/dc值為(0.1305±0.0017)mL/g，R2＝0.999。

圖1 桑葉多糖dn/dc值測定色譜圖Fig.1 dn/dc Chromatogram of mulberry leaf polysaccharides

圖2 dn/dc值的計算Fig.2 dn/dc calculation

將桑葉多糖MPL1和MPL2上HPGPC進行測定，其結(jié)果如圖3、4所示。其中，(1)顯示的是Optilab rex示差檢測器的信號，它測定的是各個組分濃度的變化，將各個峰手動積分，根據(jù)峰面積的大小即可計算出各個組分的純度；(2)顯示的DAWN HELEOS-Ⅱ型激光多角度散射檢測器的信號，它測定的是各個組分分子質(zhì)量的大小。結(jié)果表明：MPL1重均分子質(zhì)量MW為11800D，純度為94.55%，多分散性系數(shù)為1.25，MPL2重均分子質(zhì)量MW為7630D。純度為96.64%，多分散性系數(shù)為1.12。

圖3 MPL1 GPC色譜圖Fig.3 GPC Chromatogram of MPL1

圖4 MPL2 GPC色譜圖Fig.4 GPC Chromatogram of MPL2

2.2 桑葉多糖單糖組成分析

圖5 7種單糖標樣氣相色譜圖Fig.5 GC Chromatogram of mixed seven monosaccharide standards

將各種單糖標樣和桑葉多糖MPL1和MPL2乙酰化的產(chǎn)物，經(jīng)氣相色譜分析，其結(jié)果如圖5～7所示。結(jié)果表明：MPL1由D-Flu、L-Ara、L-Rha、D-Xyl和DGlu組成，其物質(zhì)的量比分別為58:9.9:5.8:5.1:21.2。MPL2單糖組成和MPL1相同，但物質(zhì)的量比不同，分別為45:6.74:17.2:7.3:24.1。

圖6 MPL1單糖組成氣相色譜圖Fig.6 GC Chromatogram of MPL1 monosaccharide composition

圖7 MPL2單糖組成氣相色譜圖Fig.7 GC Chromatogram of MPL2 monosaccharide composition

2.3 高碘酸消耗量標準曲線

將碘酸鈉和高碘酸鈉以不同比例混合后，波長223nm處測定吸光度，得高碘酸消耗量標準曲線，結(jié)果如圖8所示。

圖8 高碘酸消耗量標準曲線Fig.8 Standard curve of periodic acid consumption

2.4 高碘酸氧化

將桑葉多糖MPL1和MPL2分別溶于0.015mol/L的高碘酸鈉溶液中，分別在第1、3、5、7天測定吸光度，反應到第5天時達到平衡，代入標準曲線，計算高碘酸的消耗量。計算結(jié)果如表1所示。

表1 桑葉多糖MPL1和MPL2高碘酸氧化結(jié)果Table 1 Experimental data of periodate oxidation reaction of MPL1 and MPL2

從表1可以看出，反應生成了微量的甲酸，說明結(jié)構(gòu)中存在微量以1→6位鍵合的糖基，而高碘酸的消耗量大大多于甲酸消耗量，說明結(jié)構(gòu)中存在大量的以1→2或者1→4位鍵合的糖基。

2.5 Smith降解反應

經(jīng)過高碘酸氧化得到的產(chǎn)物，還原得到多糖醇產(chǎn)物，再通過水解和乙酰化，經(jīng)氣相色譜分析產(chǎn)物，結(jié)果如圖9、10所示。結(jié)果表明：MPL1產(chǎn)物甘油和葡萄糖的物質(zhì)的量比為26.7:73.3，MPL2產(chǎn)物甘油和葡萄糖的物質(zhì)的量比為57.2:42.8，檢測出甘油說明結(jié)構(gòu)中存在大量以1→2或者1→6位鍵合的糖基，而高碘酸氧化的結(jié)果顯示1→6位鍵合的糖基僅微量的存在，因此可以推斷出該結(jié)構(gòu)中存在1→2位鍵合的糖基。產(chǎn)物中還檢測到了大量的葡萄糖的存在說明主要存在以1→3位鍵合的糖基，MPL1中1→2 位鍵合糖基與1→3鍵合糖基物質(zhì)的量比為0.18:1，MPL2中1→2 位鍵合糖基與1→3鍵合糖基物質(zhì)的量比為0.66:1，因此可以推斷出桑葉多糖的主干為1→3位鍵合的糖基，而1→2位鍵合的糖基存在于分子的支鏈，1→6位鍵合的糖基位于分子的末端。

圖9 MPL1 Smith反應氣相色譜圖Fig.9 GC Chromatogram of the Smith reaction products of MPL1

圖10 MPL2 Smith反應氣相色譜圖Fig.10 GC Chromatogram of the Smith reaction products of MPL2

2.6 桑葉多糖紅外光譜分析

圖11 MPL1紅外光譜圖Fig.11 IR Chromatogram of MPL1

圖12 MPL2紅外光譜圖Fig.12 IR Chromatogram of MPL2

由圖11、12分析可知，3428cm-1左右出現(xiàn)的寬峰是糖類物質(zhì)O—H和分子內(nèi)或者分子間氫鍵的伸縮振動，1670cm-1為乙?；孽０坊鶊F吸收峰，1384cm-1則很可能是C—H的變角振動吸收峰，1060cm-1則可能是C—O—C或者C—O伸縮振動吸收峰，835cm-1為C—H的α構(gòu)型吸收峰。

綜上所述，MPL1的主鏈重復單元可能為：→3)-α-D-Glu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3) -α-D-Flu-(1→3)-α-D-Glu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Glu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1→；支鏈重復單元可能為：2→)-α-D-Xyl-(1→2)-α-L-Rha-(1→2)-α-L-Ara-(1→2)-α-L-Ara-(1→。

MPL2的主鏈重復單元可能為：→3)-α-D-Glu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)α-D-Glu-(1→3)-α-D-Flu-(1→3)-α-D-Flu-(1；支鏈重復單元可能為：→2)-α-L-Ara-(1→2)-α-D-Xyl-(1→2)-α-L-Rha-(1→2) -α-L-Rha- (1→。

3 結(jié) 論

本實驗采用了HPGPC對桑葉多糖的dn/dc值以及分子質(zhì)量進行了測定，結(jié)果表明桑葉多糖的dn/dc值為0.1305mL/g，MPL1的重均分子質(zhì)量為11800D，純度為94.55%，多分散性系數(shù)為1.25，MPL2的重均分子質(zhì)量為7630D，純度為96.64%，多分散性系數(shù)為1.12。利用GC對單糖組成進行了分析，MPL1和MPL2均由D-果糖(D-Flu)、L-阿拉伯糖(L-Ara)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-木糖(D-Xyl)和D-葡萄糖(D-Glu)組成，其物質(zhì)的量比MPL1為58:9.9:5.8:5.1:21.2。MPL2為45:6.74:17.2:7.3:24.1。高碘酸氧化和Smith降解反應表明桑葉多糖的主干為1→3位鍵合的糖基，而1→2位鍵合的糖基存在于分子的支鏈，1→6位鍵合的糖基可能位于分子的末端。IR結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)為α構(gòu)型。

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Composition and Structure Characterization of Two Mulberry Leaf Polysaccharide Fractions

LUO Jing-jie，CAO Xue-li*
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

TS201.23

A

1002-6630(2010)17-0136-05

2010-06-30

羅晶潔(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為生物分離工程。E-mail：luojingjie268@163.com

*通信作者：曹學麗(1967—)，女，教授，博士，研究方向為生物分離技術(shù)。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn