• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    凡納濱對(duì)蝦主要過敏原鑒定及酶法消減技術(shù)的研究

    2010-10-19 05:26:48吳海明胡志和王麗娟
    食品科學(xué) 2010年17期
    關(guān)鍵詞:凡納濱物質(zhì)量豚鼠

    吳海明,胡志和*,王麗娟

    (天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134)

    凡納濱對(duì)蝦主要過敏原鑒定及酶法消減技術(shù)的研究

    吳海明,胡志和*,王麗娟

    (天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津 300134)

    以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象,用免疫印跡法檢測(cè)其主要過敏原蛋白組分;用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦水溶性蛋白水解,消減過敏原。并且通過間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和致敏豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)對(duì)過敏原消減情況進(jìn)行檢測(cè),確定酶法消減過敏原條件。結(jié)果表明,凡納濱對(duì)蝦的主要過敏原為99、33、19kD以及14kD的蛋白質(zhì)組分。胰蛋白酶最佳水解條件為:pH8.0,酶與底物比1:100(m/m,下同),45℃,底物質(zhì)量濃度3g/100mL,水解時(shí)間3h;木瓜蛋白酶最佳水解條件為pH6.5,酶與底物比1:100,60℃,底物質(zhì)量濃度3g/100mL,水解時(shí)間3h;菠蘿蛋白酶最佳水解條件:pH7.5,酶與底物比1:100,55℃,底物質(zhì)量濃度5g/100mL,水解時(shí)間3h。并且胰蛋白酶水解產(chǎn)物和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)致敏豚鼠的全身免疫實(shí)驗(yàn)安全性很好。

    凡納濱對(duì)蝦;過敏原消減;蛋白酶水解;酶聯(lián)免疫

    Abstract:The major allergenic protein components inLitopenaeus vannameiwere determined by Western blotting. Either trypsin, papain or bromelain was used to hydrolyze water-soluble proteins fromLitopenaeus vannameifor the elimination of allergens. ELISA and general immunity experiments in allergic guinea pigs were used to evaluate the elimination of allergens. The optimum hydrolysis conditions for achieving a maximum elimination of allergens were also determined. The results showed that the major allergens inLitopenaeus vannameiwere found to have molecular weights of 99, 33, 19 kD and 14 kD, respectively. The optimal conditions for trypsin hydrolysis were as follows:pH 8.0, hydrolysis temperature 45 ℃, enzyme-to-substrate ratio 1:100, protein concentration 3 g/100 mL and hydrolysis time 3 h; those for papain digestion were pH 6.5, hydrolysis temperature 60 ℃, enzyme-to-substrate ratio 1:100, protein concentration 3 g/100 mL and hydrolysis time of 3 h; and pH of 7.5, hydrolysis temperature of 55 ℃, enzyme-substrate ratio of 1:100, protein concentration of 5 g/100 mL and hydrolysis time of 3 h were found optimum for bromelain hydrolysis. The hydrolysates derived from trypsin and papain hydrolysis were safer for allergic guinea pigs.

    Key words:Litopenaeus vannamei;allergen elimination;hydrolysis;ELISA

    近年來食品安全問題受到越來越多人的重視,過敏疾病的發(fā)病率越來越高,全世界約有30%~40%的人患有各種各樣的過敏疾病,且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1],過敏疾病被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)定為當(dāng)今世界性的重大衛(wèi)生問題之一。在西方發(fā)達(dá)國家,有2.5%的成年人和6%~8%的兒童會(huì)對(duì)某些食品過敏[2]。美國有600~700萬的過敏患者,每年平均有100~125例因食品過敏而致死的病例。在這些引起過敏的食品中,蝦及其制品產(chǎn)品是其中重要的一類[3-5],有關(guān)食用或加工海產(chǎn)品導(dǎo)致過敏的報(bào)道層出不窮[6-11]。蛋白酶能夠?qū)Nr過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞,破壞過敏原的抗原表位,從而降低過敏原的免疫活性。通過篩選出高效專一性的酶對(duì)過敏原進(jìn)行定向酶解,可以有效的降低過敏原。本實(shí)驗(yàn)以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象,對(duì)其蛋白質(zhì)抽提后鑒定其主要過敏原,并用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)其蛋白抽提物水解,通過間接酶聯(lián)免疫技術(shù)和致敏豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)對(duì)水解后過敏原消減的程度進(jìn)行檢測(cè)。以期為開發(fā)低敏性凡納濱對(duì)蝦蝦制品提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    新鮮活的凡納濱對(duì)蝦 市售;伊利高蛋白脫脂奶粉內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

    海蝦過敏人血清(臨床癥狀均為喉嚨癢,嚴(yán)重時(shí)全身腫)、海蝦非過敏人血清 天津商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院(自制),血清均放在-25℃的冰箱中凍存。

    胰蛋白酶(try p s in,250 U/mg)、木瓜蛋白酶(papain,2U/mg)、菠蘿蛋白酶(bromelain,6U/mg)、HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體 美國Sigma公司;Westren發(fā)光檢測(cè)試劑盒 普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司;柯達(dá)XBT-1型醫(yī)用X射線膠片 北京世紀(jì)紅門科技有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密pH計(jì) 天津市盛邦科學(xué)儀器有限公司;KDC-160HR型高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;FA1104N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司;Centrifuge5424型離心機(jī) Eppendorf公司;Trans-Blot SD cell電轉(zhuǎn)化儀、UNIVERSAL HOOD Ⅱ凝膠電泳成像儀 美國Bio-Rad公司;RT-6000型酶標(biāo)分析儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    英國種豚鼠,200~350g,健康,雌雄兼用。

    1.4 方法

    1.4.1 過敏原的提取

    將蝦去殼去頭去尾去腸線后放在勻漿器中勻漿,1g組織大約用1mL的生理鹽水懸浮,將該懸浮液在冰上懸浮5min后加入4倍體積的冷丙酮(-20℃預(yù)冷過夜),充分混勻,于0℃作用30min,期間混勻數(shù)次。4℃、8000r/min離心15min,收集沉淀物,沉淀物用冷丙酮重懸并混勻,再在4℃、8000r/min離心15min,將沉淀物轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上,分散并讓其在室溫下空氣中風(fēng)干后為丙酮粉[12-13]。

    取丙酮粉與抽提液(1mol/L KCl、0.5mmol/L DTT(1,4-dithiothreitol,pH7.4))按1:10(m/V)的比例抽提過夜,4℃、8000r/min離心15min后,取上清,沉淀用抽提液繼續(xù)抽提4h,離心取上清。透析過夜,兩次獲得的上清液合并后冷凍干燥,于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4.2 免疫印跡(western-blotting)

    采用SDS-PAGE電泳體系,分離膠12%,濃縮膠為5%進(jìn)行電泳后將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。待測(cè)蛋白條帶進(jìn)行免疫印跡檢測(cè),將膜置于封閉液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂乳的TBST)中室溫封閉2h,期間確保膜與封閉液完全接觸。倒掉封閉液后用TBST洗膜3次,每次10min,洗膜結(jié)束后加一抗即過敏人血清(陰性對(duì)照加入非海蝦過敏人血清)反應(yīng)1h,反應(yīng)結(jié)束后用TBST洗滌10min,連續(xù)洗滌3次后,加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgE室溫下孵育1h,用TBST連續(xù)洗滌3次,每次10min,將Westren發(fā)光檢測(cè)試劑盒的A液和B液等體積混合后加到膜表面,反應(yīng)30s后通過X光片進(jìn)行曝光,顯影定影后水沖凈室溫下晾干,標(biāo)記好蛋白標(biāo)準(zhǔn)后拍照。

    1.4.3 3種蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物

    1.4.3.1 胰蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物

    在用胰蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物進(jìn)行水解時(shí),以酶與底物比(m/m)、底物質(zhì)量濃度和pH值為影響因素。在水解溫度45℃,pH8.0,底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下,改變酶與底物比(1:50、1:100、1:200、1:500);在水解溫度45℃,pH8.0,酶與底物比1:100的條件下,改變底物質(zhì)量濃度(3、5、7、9 g/100mL);在水解溫度45℃,酶與底物比1:100,底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下,改變pH值(7.0、7.5、8.0、8.5)進(jìn)行水解。水解3h后,將反應(yīng)體系置于80℃,10min使酶失活,將水解物離心處理后進(jìn)行冷凍干燥,然后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

    1.4.3.2 木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物

    在用木瓜蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物進(jìn)行水解時(shí),以酶與底物比、底物質(zhì)量濃度和pH值為影響因素。在水解溫度60℃、pH6.5、底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下,改變酶與底物比(1:50、1:100、1:200、1:500);在水解溫度60℃、pH6.5、酶與底物比1:100的條件下,改變底物質(zhì)量濃度(3、5、7、9g/100mL);在水解溫度60℃、酶與底物比1:100、底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下,改變pH值(6.0、6.5、7.0、7.5)進(jìn)行水解。水解3h后,將反應(yīng)體系置于80℃,10min使酶失活,將水解物離心處理后進(jìn)行冷凍干燥,然后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

    1.4.3.3 菠蘿蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物

    在用菠蘿蛋白酶對(duì)凡納濱對(duì)蝦蛋白抽提物進(jìn)行水解時(shí),以酶與底物比、底物質(zhì)量濃度和pH值為影響因素。在水解溫度為55℃、pH7.0、底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下,改變酶與底物比(1:50、1:100、1:200、1:500);在水解溫度為55℃、pH7.0、酶與底物比1:100的條件下,改變底物質(zhì)量濃度(3、5、7、9g/100mL);在水解溫度55℃、酶與底物比1:100、底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下,改變pH值(6.5、7.0、7.5、8.0)進(jìn)行水解。水解3h后,將反應(yīng)體系置于80℃,10min使酶失活,將水解物離心處理后進(jìn)行冷凍干燥,然后對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

    1.4.4 間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)水解物檢測(cè)

    在對(duì)水解后的凡納濱對(duì)蝦水解物過敏性消減程度進(jìn)行檢測(cè)時(shí)用未水解的蝦蛋白抽提物作為陽性對(duì)照,用正常人血清作為一抗作為陰性對(duì)照。

    包被抗原時(shí)為減小誤差每6孔作為一組,每板有1組做空白,在酶標(biāo)板中每孔加入100μL質(zhì)量濃度為10mg/mL后4℃放置過夜后用洗滌液(PBST)洗滌3次,每次5min,在濾紙上拍干后每孔加入封閉液(含1g/100mL BSA的PBST)200μL,37℃水浴2h。封閉結(jié)束后,同樣用洗滌液洗滌3次,每次5min,拍干后每孔加一抗(含1g/100mL BSA的PBST將海蝦過敏人血清稀釋20倍)100μL,37℃水浴2h后洗滌,拍干后加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgE 37℃水浴2h后洗滌,拍干后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液室溫放置15min,每孔加入50μL終止液(5mol/L H2SO4)后在492nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD492nm值[14]。

    1.4.5 豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫和間接酶聯(lián)免疫的檢測(cè)結(jié)果,將3種蛋白酶(胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶)水解后對(duì)過敏原性消減最好條件的蛋白做豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)。每組6只豚鼠,雌雄各半,豚鼠腹腔注射3次(隔天注射),每次1mL/只,7d后足趾靜脈注射2mL/只進(jìn)行激發(fā),分組見表1,激發(fā)后觀察動(dòng)物現(xiàn)象[15]。

    表1 豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)分組Table 1 Grouping of guinea pigs for general immunity experiments

    2 結(jié)果與分析

    2.1 凡納濱對(duì)蝦主要過敏原的鑒定

    蝦蛋白質(zhì)抽提物經(jīng)SDS-PAGE后,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析得知凡納濱對(duì)蝦的蛋白質(zhì)組分有15條可辨蛋白帶,如圖1所示,分子質(zhì)量為174、99、79、68、59、48、42、40、33、24、19、17、14、12、11kD,主要蛋白質(zhì)組分分子質(zhì)量為33kD。

    圖1 凡納濱對(duì)蝦電泳蛋白質(zhì)抽提物的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of protein extracts fromLitopenaeus vannamei

    圖2 凡納濱對(duì)蝦過敏原免疫印跡鑒定Fig.2 Western blotting analysis of allergens inLitopenaeus vannamei

    從圖2的免疫印跡結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),不同的海蝦過敏人對(duì)凡納濱對(duì)蝦的免疫印跡結(jié)果幾乎相同。凡納濱對(duì)蝦蛋白質(zhì)組分出現(xiàn)陽性反應(yīng)的組分分子質(zhì)量為99、68、59、48、33、19kD以及14kD。因?yàn)樵诿庖哂≯E檢測(cè)中不僅可以檢測(cè)出抗原抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng),還會(huì)有一些非抗原抗體之間的非特異性結(jié)合反應(yīng),為進(jìn)一步說明哪些蛋白組分為研究的主要過敏原,用海蝦非過敏人的血清作為一抗進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照,一位海蝦非過敏人血清和30位海蝦非過敏人混合血清作為一抗出現(xiàn)的非特異性蛋白幾乎相同,凡納濱對(duì)蝦的非特異性反應(yīng)蛋白質(zhì)組分分子質(zhì)量為68、59kD和48kD,去除非特異性反應(yīng)的蛋白組分可知,凡納濱對(duì)蝦的主要過敏原為99、33、19kD以及14kD的蛋白質(zhì)組分。

    2.2 間接酶聯(lián)免疫法對(duì)3種蛋白酶水解物檢測(cè)結(jié)果

    在用蛋白酶水解過程中不同蛋白酶的水解溫度依次為:胰蛋白酶為45℃、木瓜蛋白酶為60℃、菠蘿蛋白酶為55℃,水解時(shí)間均為3h,控制酶與底物比、pH值和底物質(zhì)量濃度3個(gè)參數(shù)的變化,結(jié)果見表2~4。

    采用間接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)用上述3種蛋白酶水解后的凡納濱對(duì)蝦蛋白過敏原性消減程度檢測(cè)時(shí),以未水解的蛋白抽提物為陽性對(duì)照組,同時(shí)以30位海蝦非過敏人血清作為一抗進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)作為陰性對(duì)照組,陽性對(duì)照組的OD492nm值為0.585,陰性對(duì)照組的OD492nm值在0.03~0.05之間,陰性對(duì)照組的總體OD492nm均值為0.038。3種不同對(duì)蝦蛋白水解物的OD492nm值均低于陽性對(duì)照組的OD492nm值。經(jīng)胰蛋白酶在pH8.0,酶與底物比1:100,45℃,底物質(zhì)量濃度3g/100mL的條件下水解后檢測(cè)其OD492nm值為0.075;木瓜蛋白酶水解時(shí)在pH6.5,酶與底物比1:100,60℃,底物質(zhì)量濃度3g/100mL的條件下水解后檢測(cè)其OD492nm值為0.054;菠蘿蛋白酶水解時(shí)在pH7.5,酶與底物比1:100,55℃,底物質(zhì)量濃度5g/100mL的條件下水解后檢測(cè)其OD492nm值為0.148。經(jīng)3種蛋白酶在其最佳水解條件下水解蝦蛋白,對(duì)其過敏原性消減較好,但也略高于陰性對(duì)照組的OD492nm值。

    表2 胰蛋白酶水解蝦蛋白的產(chǎn)物與過敏人血清反應(yīng)的OD492nm值(±s,n= 6)Table 2 OD value of trypsin-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

    表2 胰蛋白酶水解蝦蛋白的產(chǎn)物與過敏人血清反應(yīng)的OD492nm值(±s,n= 6)Table 2 OD value of trypsin-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

    分組 酶與底物比 底物質(zhì)量濃度/(g/100mL) pH 平均OD492nm值1 1:50 5 8.0 0.229±0.0262 1:100 5 8.0 0.243±0.0063 1:200 5 8.0 0.280±0.0174 1:500 5 8.0 0.412±0.0125 1:100 3 8.0 0.075±0.0216 1:100 5 8.0 0.243±0.0067 1:100 7 8.0 0.379±0.0298 1:100 9 8.0 0.380±0.0249 1:100 5 7.0 0.487±0.03310 1:100 5 7.5 0.432±0.02811 1:100 5 8.0 0.243±0.00612 1:100 5 8.5 0.283±0.010陽性對(duì)照組 0.585±0.014陰性對(duì)照組 0.038±0.001

    表3 木瓜蛋白酶水解蝦蛋白的產(chǎn)物與過敏人血清反應(yīng)的OD492nm值(±s,n= 6)Table 3 OD value of papain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

    表3 木瓜蛋白酶水解蝦蛋白的產(chǎn)物與過敏人血清反應(yīng)的OD492nm值(±s,n= 6)Table 3 OD value of papain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

    分組 酶與底物比 底物質(zhì)量濃度/(g/100mL) pH 平均OD492nm值1 1:50 5 6.5 0.202±0.0252 1:100 5 6.5 0.237±0.0173 1:200 5 6.5 0.267±0.0264 1:500 5 6.5 0.464±0.0305 1:100 3 6.5 0.054±0.0066 1:100 5 6.5 0.237±0.0177 1:100 7 6.5 0.445±0.0278 1:100 9 6.5 0.478±0.0329 1:100 5 6.0 0.347±0.03510 1:100 5 6.5 0.237±0.01711 1:100 5 7.0 0.261±0.02212 1:100 5 7.5 0.321±0.019陽性對(duì)照組 0.585±0.014陰性對(duì)照組 0.038±0.001

    表4 菠蘿蛋白酶水解蝦蛋白的產(chǎn)物與過敏人血清反應(yīng)的OD492nm值(±s,n= 6)Table 4 OD value of bromelain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

    表4 菠蘿蛋白酶水解蝦蛋白的產(chǎn)物與過敏人血清反應(yīng)的OD492nm值(±s,n= 6)Table 4 OD value of bromelain-hydrolyzed shrimp protein reacted with allergic human serum

    分組 酶與底物比 底物質(zhì)量濃度/(g/100mL) pH 平均OD492nm值1 1:50 5 7.0 0.261±0.0212 1:100 5 7.0 0.265±0.0123 1:200 5 7.0 0.272±0.0234 1:500 5 7.0 0.462±0.0395 1:100 3 7.0 0.264±0.0116 1:100 5 7.0 0.265±0.0127 1:100 7 7.0 0.443±0.0408 1:100 9 7.0 0.464±0.0319 1:100 5 6.5 0.421±0.02710 1:100 5 7.0 0.265±0.01211 1:100 5 7.5 0.148±0.00712 1:100 5 8.0 0.288±0.015陽性對(duì)照組 0.585±0.014陰性對(duì)照組 0.038±0.001

    2.3 豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過敏原消減結(jié)果

    在豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)中所用陽性對(duì)照蛋白為未水解的凡納濱對(duì)蝦蛋白(組別1),分別對(duì)3種蛋白酶在最佳水解條件下的蝦蛋白水解物進(jìn)行動(dòng)物全身免疫實(shí)驗(yàn)。其中組別2~4,致敏蛋白為未水解的蝦蛋白,組別5~7依次為胰蛋白酶最佳水解物(OD492nm值為0.075)、木瓜蛋白酶最佳水解物(OD492nm值為0.054)、菠蘿蛋白酶最佳水解物(OD492nm值為0.148)。豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

    表5 豚鼠全身免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 5 Results of general immunity experiments in guinea pigs

    從表5可以看出,用0.1g/100mL未水解蝦蛋白致敏豚鼠3次后,再經(jīng)0.1g/100mL未水解蝦蛋白激發(fā)后發(fā)現(xiàn),豚鼠死亡率為100%,說明過敏型豚鼠模型建立成功。用未水解的蝦蛋白致敏豚鼠,再經(jīng)胰蛋白酶最佳水解物激發(fā)后豚鼠均正常,無死亡;用未水解的蝦蛋白致敏豚鼠,再經(jīng)木瓜蛋白酶最佳水解物激發(fā)后豚鼠均正常,無死亡;用未水解的蝦蛋白致敏豚鼠,再經(jīng)菠蘿蛋白酶最佳水解物激發(fā)后有兩例死亡,死亡率達(dá)33.3%。

    3 討論與結(jié)論

    通過SDS-PAGE以及免疫印跡的結(jié)果發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)強(qiáng)陽性抗原抗體特異性反應(yīng)的蛋白并不一定是蛋白質(zhì)組分含量相對(duì)多的條帶,例如凡納濱對(duì)蝦其蛋白質(zhì)組分在14kD的蛋白含量明顯低于分子質(zhì)量在33kD的蛋白組分,但在14kD的蛋白質(zhì)組分免疫印跡結(jié)果明顯強(qiáng)于在33kD的蛋白質(zhì)組分。

    我國也有學(xué)者從凡納濱對(duì)蝦中提取海蝦的主要過敏原[16]。在初步分離的蛋白質(zhì)組分中分子質(zhì)量36kD的蛋白含量較高,用海蝦過敏者血清及陽性血清池鑒定主要過敏原,鑒定36kD的蛋白為主要過敏原。但在用陽性血清池鑒定該對(duì)蝦主要過敏原的實(shí)驗(yàn)中,沒有陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn),說明在36kD的蛋白未必是非特異性反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)研究中凡納濱對(duì)蝦的蛋白初步分離組分中33kD的蛋白含量較高,但通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照發(fā)現(xiàn),分子質(zhì)量為33kD的組分不是其主要過敏原。

    凡納濱對(duì)蝦在經(jīng)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解后,其過敏原性都有一定的消減作用,通過酶聯(lián)免疫的結(jié)果可知,胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)于凡納濱對(duì)蝦過敏原消除效果較好,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全性也很高。

    [1] GEHA R S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy hypersensitivity[J]. Curr Opin Immunol, 2003, 15(6):603-608.

    [2] HANSON L, TELEMO E. The growing allergy problem[J]. Acta Paediatr, 1997, 86(9):916-918.

    [3] YUNGIGER J W. Fatal food-induced anaphylaxis[J]. Am Med Assoc,1998, 260(10):1450-1452.

    [4] SAMPSON H A, MENDELSON L, ROSEN J P. Fatal and near-fatal anaphylactic reaction to food in children and adolescents[J]. The New England Journal of Medicine, 1992, 327(6):380-384.

    [5] 呂相征, 劉秀梅, 楊曉光. 健康人群食物過敏狀況的初步調(diào)查[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2005, 17(2):119-121.

    [6] LEMIERE C, DESJARDINS A, LEHRER S, et al. Occupational asthma to lobster and shrimp[J]. Allergy, 1996, 51(4):272-273.

    [7] GADDIE J, LEGGE J, REID T M S. Pulmonary hypersensitivity in prawn workers[J]. Lancet, 1980, 316(8208):1350-1353.

    [8] GOETZ D W, WHISMAN B A. Occupational asthma in a seafood restaurant worker:cross-reactivity of shrimp and scallops[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2000, 85(6 Pt 1):461-466.

    [9] KIM W H, LEE S K, LEE H C, et al. Shell:Grinder’s asthma[J]. Yonsei Med J, 1982, 23(2):123-130.

    [10] 安愛芝, 孫月芹. 食坑蝦引起過敏性休克1例[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2003, 16(8):877.

    [11] 許巖, 許紅. 食用蝦爬子引起過敏性休克1例[J]. 沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000, 2(2):108.

    [12] 王曉雯. 中國對(duì)蝦主要過敏原的鑒定及性質(zhì)的研究[D]. 青島:中國海洋大學(xué), 2008.

    [13] 趙振興. 蝦過敏原免疫活性的研究[D]. 青島:中國海洋大學(xué), 2006.

    [14] 白振宇. 牛奶中主要過敏原的消除及檢測(cè)技術(shù)的研究[D]. 天津:天津商業(yè)大學(xué), 2007.

    [15] 徐叔云, 卞如濂, 陳修, 等. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 1991:1196-1203.

    [16] 李振興, 林洪, 李明華, 等. 不同蝦類的過敏原及其過敏原性[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2005, 30(2):281-284.

    Identification and Enzymatic Elimination of Major Allergens inLitopenaeus vannamei

    WU Hai-ming,HU Zhi-he*,WANG Li-juan
    (Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134, China)

    R392.8;S917

    A

    1002-6630(2010)17-0272-05

    2010-01-19

    “十一五”國家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2008BAD94B09)

    吳海明(1986—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:wuhaiming-22@163.com

    *通信作者:胡志和(1962—),男,教授,碩士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:hzhihe@tjcu.edu.cn

    猜你喜歡
    凡納濱物質(zhì)量豚鼠
    水庫工程區(qū)水土保持生態(tài)服務(wù)價(jià)值估算
    人民黃河(2020年12期)2020-12-30 12:55:30
    施肥量對(duì)谷子干物質(zhì)量積累及分配的影響
    不同播期與品種對(duì)糯玉米干物質(zhì)積累的影響
    《豚鼠特工隊(duì)》:身懷絕技的動(dòng)物007
    凡納濱對(duì)蝦白斑綜合征病毒防治研究進(jìn)展(一)
    一種柱狀金屬物質(zhì)量檢測(cè)器的研究
    電子制作(2017年10期)2017-04-18 07:23:14
    肺豚鼠耳炎諾卡菌病1例
    凡納濱對(duì)蝦與點(diǎn)帶石斑魚的混養(yǎng)模式
    做瑜伽的小豚鼠
    軍事文摘(2015年6期)2015-06-16 08:47:58
    做瑜伽的小豚鼠
    国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩成人伦理影院| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产精品sss在线观看| 特级一级黄色大片| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲欧美日韩东京热| 色哟哟哟哟哟哟| 国产乱人视频| 日韩制服骚丝袜av| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美zozozo另类| 久久久色成人| 一本一本综合久久| 国产视频首页在线观看| 草草在线视频免费看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国语自产精品视频在线第100页| 晚上一个人看的免费电影| 久久韩国三级中文字幕| www.色视频.com| 天堂中文最新版在线下载 | eeuss影院久久| 婷婷精品国产亚洲av| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲成人久久爱视频| 一级二级三级毛片免费看| 精品久久久久久久久亚洲| 黄色配什么色好看| 99久久人妻综合| 久久久色成人| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 哪个播放器可以免费观看大片| 色综合色国产| av在线老鸭窝| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 免费看美女性在线毛片视频| 26uuu在线亚洲综合色| 黄色日韩在线| 国产探花在线观看一区二区| a级毛色黄片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av国产免费在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 精华霜和精华液先用哪个| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 99久久九九国产精品国产免费| 少妇熟女欧美另类| a级毛片免费高清观看在线播放| 欧美精品一区二区大全| 国产探花在线观看一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 美女国产视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 日本午夜av视频| 亚洲成色77777| 一个人免费看片子| av女优亚洲男人天堂| 男女国产视频网站| 亚洲美女黄色视频免费看| 免费大片黄手机在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 女性被躁到高潮视频| 国产视频首页在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 韩国av在线不卡| av国产久精品久网站免费入址| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 最近中文字幕2019免费版| 国产av一区二区精品久久| 国产亚洲精品第一综合不卡 | a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美日本中文国产一区发布| 乱人伦中国视频| 午夜激情av网站| 男男h啪啪无遮挡| 中文字幕最新亚洲高清| 十分钟在线观看高清视频www| av播播在线观看一区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日日撸夜夜添| 草草在线视频免费看| 国产成人精品久久久久久| 国产毛片在线视频| 高清毛片免费看| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 中国三级夫妇交换| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品.久久久| 亚洲精品一二三| 国产高清三级在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 韩国av在线不卡| 成年人午夜在线观看视频| 热re99久久国产66热| 久久99热这里只频精品6学生| 国国产精品蜜臀av免费| 中国三级夫妇交换| 亚洲国产av新网站| 男人操女人黄网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 高清av免费在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | av在线播放精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 丰满乱子伦码专区| 国产一区二区在线观看av| 国产极品天堂在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 伦理电影大哥的女人| 亚洲无线观看免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人国语在线视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| www.av在线官网国产| 欧美+日韩+精品| 午夜福利,免费看| 久久亚洲国产成人精品v| 久久婷婷青草| 久久久国产欧美日韩av| 晚上一个人看的免费电影| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲色图综合在线观看| 国产精品免费大片| 视频区图区小说| 久久99蜜桃精品久久| 日韩一本色道免费dvd| 全区人妻精品视频| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久国产网址| 伦精品一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 精品人妻在线不人妻| 99久久精品一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩视频在线欧美| 午夜影院在线不卡| 97在线人人人人妻| 午夜精品国产一区二区电影| 久久99热6这里只有精品| 精品一区二区三区视频在线| 99久久综合免费| 观看美女的网站| 一级二级三级毛片免费看| 中国国产av一级| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 哪个播放器可以免费观看大片| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| a级毛片在线看网站| 亚洲av中文av极速乱| 高清午夜精品一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 国产av精品麻豆| 大陆偷拍与自拍| 熟女电影av网| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久99一区二区三区| 久久99一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产男女超爽视频在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 日韩成人伦理影院| 国产精品人妻久久久久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久这里有精品视频免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 考比视频在线观看| 国产毛片在线视频| 亚洲国产日韩一区二区| 大香蕉久久网| 久久国产精品大桥未久av| .国产精品久久| 欧美日韩综合久久久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久99一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品成人在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| av在线观看视频网站免费| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲av中文av极速乱| 婷婷色综合大香蕉| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久免费观看电影| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精品成人在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 飞空精品影院首页| 婷婷成人精品国产| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99久久人妻综合| 丝袜喷水一区| 久久久精品免费免费高清| 久久av网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩av在线免费看完整版不卡| 婷婷色麻豆天堂久久| 大香蕉久久成人网| 日本av免费视频播放| 国产熟女午夜一区二区三区 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 99九九线精品视频在线观看视频| 黄片播放在线免费| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲国产色片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久久久国产电影| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线观看一区二区三区激情| 少妇的逼水好多| av有码第一页| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产黄色免费在线视频| 国产一区二区三区av在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 视频区图区小说| 美女国产视频在线观看| 有码 亚洲区| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲成人手机| a级毛色黄片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲人成77777在线视频| 制服诱惑二区| 有码 亚洲区| 91久久精品国产一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 精品国产国语对白av| 在线 av 中文字幕| 久久精品久久久久久久性| 九九爱精品视频在线观看| 久久狼人影院| 日本黄色日本黄色录像| 寂寞人妻少妇视频99o| 欧美精品一区二区免费开放| 精品久久久久久电影网| 精品午夜福利在线看| 91久久精品国产一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 国产免费视频播放在线视频| 久久国内精品自在自线图片| 免费黄色在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产精品一国产av| 十分钟在线观看高清视频www| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产成人av激情在线播放 | 国产精品国产三级国产专区5o| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人精品一,二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 超色免费av| 亚洲精品乱久久久久久| 黄片播放在线免费| 国产在视频线精品| 热re99久久精品国产66热6| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 在线 av 中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 国产精品国产av在线观看| 国产成人精品在线电影| 婷婷色麻豆天堂久久| 色吧在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 在线 av 中文字幕| 内地一区二区视频在线| 午夜视频国产福利| 国产精品 国内视频| 18禁在线播放成人免费| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲欧美清纯卡通| 人妻系列 视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 在线精品无人区一区二区三| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品一国产av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久精品久久久久久久性| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 欧美日韩av久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 成人综合一区亚洲| 色94色欧美一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 日本av免费视频播放| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久伊人网av| 亚洲av成人精品一二三区| 伦理电影免费视频| 亚洲欧美清纯卡通| 超碰97精品在线观看| 免费少妇av软件| 亚洲av二区三区四区| 一区二区三区精品91| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲成人一二三区av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费观看av网站的网址| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 午夜91福利影院| 韩国高清视频一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 九色亚洲精品在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 大香蕉久久网| 国产精品无大码| 有码 亚洲区| 春色校园在线视频观看| 国产一级毛片在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧洲国产日韩| 日日爽夜夜爽网站| 韩国高清视频一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 制服丝袜香蕉在线| 成人国产av品久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 韩国av在线不卡| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产av精品麻豆| 日韩精品有码人妻一区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久精品夜色国产| 久久婷婷青草| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 人妻系列 视频| 美女中出高潮动态图| 亚洲人成77777在线视频| 看非洲黑人一级黄片| 天美传媒精品一区二区| 国产乱来视频区| 亚洲精品一二三| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 少妇的逼好多水| 国内精品宾馆在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黄色配什么色好看| 大香蕉久久成人网| 激情五月婷婷亚洲| 简卡轻食公司| 免费人成在线观看视频色| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚州av有码| 亚洲四区av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 一级毛片 在线播放| 国产在视频线精品| 欧美97在线视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一级毛片 在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 久久精品国产亚洲av天美| 波野结衣二区三区在线| 亚洲综合色惰| 午夜福利影视在线免费观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 久热这里只有精品99| 日韩av不卡免费在线播放| 激情五月婷婷亚洲| 国产精品国产三级国产专区5o| 另类亚洲欧美激情| 日韩一本色道免费dvd| 日韩av免费高清视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲第一av免费看| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜激情久久久久久久| 国产精品99久久99久久久不卡 | 18禁动态无遮挡网站| 国产成人freesex在线| 成人国产麻豆网| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲少妇的诱惑av| 免费观看在线日韩| 亚洲内射少妇av| 99热6这里只有精品| 亚洲精品一二三| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人精品福利久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩免费高清中文字幕av| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丰满乱子伦码专区| 99热全是精品| 亚洲性久久影院| 草草在线视频免费看| 高清欧美精品videossex| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 日日啪夜夜爽| 精品国产露脸久久av麻豆| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品久久久久成人av| 欧美97在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲情色 制服丝袜| 免费黄网站久久成人精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲综合色网址| 少妇人妻精品综合一区二区| 色5月婷婷丁香| 日本午夜av视频| 丝袜美足系列| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久免费观看电影| 久久99热这里只频精品6学生| 久久精品国产亚洲av天美| 免费观看在线日韩| √禁漫天堂资源中文www| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲综合精品二区| 麻豆成人av视频| 制服丝袜香蕉在线| 多毛熟女@视频| 国产69精品久久久久777片| 黄色一级大片看看| 女人精品久久久久毛片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 少妇的逼水好多| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品成人在线| 最后的刺客免费高清国语| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 最黄视频免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人免费无遮挡视频| av在线app专区| 欧美三级亚洲精品| 男女国产视频网站| 国产精品蜜桃在线观看| 免费观看av网站的网址| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产成人精品一,二区| 久久久午夜欧美精品| 亚洲成人手机| 午夜免费观看性视频| 婷婷色综合大香蕉| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 免费观看的影片在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日日爽夜夜爽网站| 日韩视频在线欧美| 观看av在线不卡| 亚洲av免费高清在线观看| 麻豆成人av视频| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 满18在线观看网站| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜影院在线不卡| 午夜av观看不卡| 99久久精品国产国产毛片| 中国美白少妇内射xxxbb| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲成人一二三区av| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久99蜜桃精品久久| 久久国内精品自在自线图片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 精品久久久久久久久亚洲| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 中文字幕久久专区| 精品久久久久久久久亚洲| av女优亚洲男人天堂| 九草在线视频观看| 精品久久国产蜜桃| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久午夜福利片| 中国美白少妇内射xxxbb| 各种免费的搞黄视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 中文天堂在线官网| 午夜福利视频精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 久久久精品区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日日撸夜夜添| 成人二区视频| 两个人的视频大全免费| 国产成人免费无遮挡视频| 97超碰精品成人国产| 色哟哟·www| 精品一区二区三卡| 成人国语在线视频| 国产乱人偷精品视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美3d第一页| 超色免费av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在现免费观看毛片| 国产成人精品久久久久久| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品人妻熟女av久视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 黄色怎么调成土黄色| 国产av一区二区精品久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 男女啪啪激烈高潮av片| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 免费大片18禁| 日韩欧美一区视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 中文字幕制服av| 久久99精品国语久久久| 亚洲av免费高清在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久精品免费免费高清| 黑人高潮一二区| 高清在线视频一区二区三区| av免费观看日本| 一级黄片播放器| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品日本国产第一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av福利一区| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 久久免费观看电影| 老司机亚洲免费影院| 全区人妻精品视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 一区二区三区四区激情视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品一区蜜桃| 少妇人妻 视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久99蜜桃精品久久| 在线观看三级黄色| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇丰满av| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久99蜜桃精品久久| 日韩一区二区三区影片| 午夜日本视频在线| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费观看av网站的网址| 国内精品宾馆在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 婷婷色综合www| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99九九在线精品视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产成人精品福利久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久鲁丝午夜福利片| av国产精品久久久久影院| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 黄色一级大片看看| 国精品久久久久久国模美|