藍(lán)莓多糖的抗氧化性與抑菌作用

孟憲軍，劉曉晶，孫希云，張 琦，潘 璇

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

藍(lán)莓多糖的抗氧化性與抑菌作用

孟憲軍，劉曉晶，孫希云，張 琦，潘 璇

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

利用水提醇沉法從藍(lán)莓中提取多糖，再經(jīng)初步純化后，進(jìn)行多糖的抗氧化性及抑菌作用實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，藍(lán)莓多糖對(duì)羥自由基和DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，且清除率50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50分別為2mg/mL和7mg/mL。但藍(lán)莓多糖對(duì)超氧陰離子自由基幾乎沒有作用效果。藍(lán)莓多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母均有一定的抑制作用，最小抑制濃度MIC在50～75mg/mL之間，對(duì)熱帶假絲酵母、青霉和黑曲霉無(wú)抑制作用。

藍(lán)莓多糖；抗氧化性；抑菌作用

Abstract：Polysaccharides in blueberry fruits were extracted by water extraction and ethanol precipitation, and after preliminary purification, the precipitate was assessed for its antioxidant and antimicrobial activities. The results showed that blueberry polysaccharides had a strong ability to scavenge both hydroxyl and DPPH free radicals, with IC50 values of 2 mg/mL and 7 mg/mL. However, almost no scavenging effect against superoxide anion radicals was observed. The polysaccharides could inhibit the growth of all of the following microorganisms:Bacillus subtilis,Escherichia coli,Staphylosocus aureus, andSaccharomyces cerevisiaeand the corresponding minimal inhibitory concentrations (MIC) varied from 50 to 75 mg/mL. However,no inhibitory effect onG.tropicalis,Penicilliumsp. orAspergillus nigerwas observed.

Key words：blueberry polysaccharide；antioxidant activity；antimicrobial activity

藍(lán)莓(Semen trigonellae)，又稱越橘、藍(lán)漿果。藍(lán)莓是一種耐寒性極強(qiáng)的野生植物，原產(chǎn)于北美、蘇格蘭和俄羅斯。在我國(guó)東北的大小興安嶺及海南等地區(qū)都有野生種分布，目前遼寧省不少地區(qū)也有了大面積的種植。藍(lán)莓果實(shí)不僅甜酸適度、風(fēng)味好，且營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量對(duì)人類健康有益的物質(zhì)，包括抗氧化物、鞣酸、葉酸、抗菌成分和豐富的食用纖維等，因此，常被譽(yù)為“漿果之王”。在我國(guó)古代醫(yī)學(xué)書籍中，有很多關(guān)于越橘入藥的記載。其主要功能性有：減輕眼的疲勞及提高夜間視力，保護(hù)毛細(xì)血管及抗氧化，抑制血小板凝結(jié)，預(yù)防血栓的形成及動(dòng)脈硬化，增強(qiáng)關(guān)節(jié)及軟組織的功能，對(duì)尿路感染癥有醫(yī)療效果，有抗癌作用，對(duì)與心血管疾病發(fā)生有關(guān)的生物性酶有很強(qiáng)的抑制作用等[1]。

國(guó)外對(duì)于藍(lán)莓中活性成分的研究還主要集中在花色苷上，研究了花色苷提取物的諸多生理功能以及一些加工處理對(duì)其抗氧化能力的影響[2]；對(duì)于藍(lán)莓中的黃酮類物質(zhì)的功能性也有研究。國(guó)內(nèi)對(duì)于藍(lán)莓的研究還主要集中在引種栽培技術(shù)上，對(duì)于藍(lán)莓的中活性成分的提取和開發(fā)利用方面的研究還較為落后。有關(guān)藍(lán)莓多糖的活性研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法從藍(lán)莓中提取多糖，再經(jīng)初步純化后，進(jìn)行多糖的體外抗氧化性及抑菌作用的研究，為藍(lán)莓多糖的生產(chǎn)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓購(gòu)于遼寧藍(lán)金實(shí)業(yè)有限公司，品種為藍(lán)豐。

細(xì)菌：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylosocus aureus)；真菌：青霉(Penicilliumsp.)、黑曲霉(Aspergillus niger)、熱帶假絲酵母(G.tropicalis)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、30%雙氧水、三氯乙酸、正丁醇、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(分析純) 北京豪爾思科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6050真空干燥箱 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 深圳市凱銘杰儀器有限公司；HZP-250型全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海新諾儀器設(shè)備有限公司；BOXUN超凈臺(tái) 上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓多糖樣品的制備

1.3.1.1 提取

取藍(lán)莓凍果，融化后，打漿，采用料水比1:8(m/V)加水，在90℃恒溫水浴鍋中攪拌浸提4h。取出，紗布過(guò)濾、離心。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/8，加入乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置8h。離心取沉淀，依次用丙酮、乙醚和乙醇洗滌脫脂，真空干燥，制得藍(lán)莓粗多糖。

1.3.1.2 脫色

干燥后的粗多糖，采用料水比1:2(以上述藍(lán)莓凍果計(jì)算)溶于水中，在pH8.5的條件下，加雙氧水體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%，50℃恒溫水浴4h[3]。

1.3.1.3 脫蛋白

脫色后的多糖溶液與1:10(m/V)的三氯乙酸-正丁醇等體積混合，振蕩10min，靜置1h后，棄去上層有機(jī)層和中層蛋白層，保留下層多糖溶液。重復(fù)操作3次[4]。

1.3.1.4 透析

流水透析8h，蒸餾水再透析8h，每隔1h換一次蒸餾水。

1.3.1.5 濃縮、干燥

將糖溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至最小體積，真空干燥后，得到藍(lán)莓多糖樣品。

1.3.2 藍(lán)莓多糖抗氧化性能實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 藍(lán)莓多糖對(duì)·OH清除作用的測(cè)定

采用鄰二氮菲-金屬鐵離子-H2O2體系：鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成Fe2+-鄰二氮菲配合物，該配合物在536nm波長(zhǎng)處有最大吸收；通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH；而當(dāng)·OH氧化Fe2+-鄰二氮菲成Fe3+-鄰二氮菲時(shí)，就使536nm波長(zhǎng)處最大吸收消失或減弱。當(dāng)反應(yīng)體系中存在·OH清除劑時(shí)，此氧化過(guò)程受到抑制，536nm波長(zhǎng)處最大吸收降低不明顯，故可通過(guò)536nm波長(zhǎng)處吸光度比較抗氧化劑清除·OH的作用[5]。

參照文獻(xiàn)[5-7]的方法，略作改進(jìn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)樣品組、損傷組和未損傷組。鄰二氮菲先用少量的乙醇溶解，再用水稀釋成1.5mmol/L的溶液。取上述鄰二氮菲溶液1.0mL，加pH7.4、0.2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)2.0mL，充分混勻后，加1.5mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0mL，加入樣品溶液1.0mL，每加一管立即混勻，加0.01% H2O2溶液1.0mL。反應(yīng)在37℃恒溫水浴中進(jìn)行，準(zhǔn)確反應(yīng)1h后，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。損傷組中用1.0mL去離子水代替樣品溶液；未損傷組中用2.0mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。按式(1)計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率(I)，并求出清除率50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50。

式中：AX為樣品組吸光度；A0為未損傷組吸光度；A1為損傷組吸光度。

1.3.2.2 藍(lán)莓多糖對(duì)O2·清除作用的測(cè)定

采用改良的鄰苯三酚自氧化法[8-10]，用10mmol/L HCl溶解鄰苯三酚，制得250mmol/L的溶液。取pH8.0、2.99mL 50mmol/mL的Tris-HCl緩沖溶液于試管中，加入10μL上述鄰苯三酚溶液(同時(shí)按秒計(jì)時(shí))，立即攪拌混勻，倒入1cm光徑比色杯中在325nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，1min后開始計(jì)數(shù)據(jù)，每隔30s記一次，一直記到4min。對(duì)照管以10μL 10mmol/mL HCl代替鄰苯三酚。

自氧化速率(I0)：線性范圍內(nèi)，每分鐘的吸光度的增值。實(shí)際計(jì)算取4min內(nèi)平均每分鐘吸光度的增值。要求I0達(dá)到0.07/min，若達(dá)不到此速率可通過(guò)調(diào)整鄰苯三酚的濃度來(lái)達(dá)到。

式中：A1為1min時(shí)的吸光度；A4為4min時(shí)的吸光度。

樣品活性測(cè)定：樣品管代替自氧化管，為消除色素影響，取2.98mL pH8.050mmol/mL的Tris-HCl緩沖溶液，加入10μL的樣品溶液，再加入10μL 250mmol/mL的鄰苯三酚。其余步驟同上。計(jì)算加樣后鄰苯三酚自氧化速率(IX)，算出對(duì)O2·清除率(I)。

1.3.2.3 藍(lán)莓多糖對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定

利用DPPH乙醇溶液在517nm波長(zhǎng)處有紫色團(tuán)的特征吸收峰。加入抗氧化劑后，在517nm波長(zhǎng)處吸光度的下降表示抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力[11-12]。

準(zhǔn)確稱取0.0100g DPPH溶解在無(wú)水乙醇中，用250mL棕色容量瓶定容，放入冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)樣品組和兩個(gè)對(duì)照組。在2mL的DPPH醇溶液中加入2mL樣品溶液，混勻后避光反應(yīng)30min，立即在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照組1中用2mL去離子水代替樣品溶液。對(duì)照組2中用2mL去離子水代替2mL DPPH醇溶液[13]。按下式計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率(I)，并求出清除率50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50。

式中：A1為對(duì)照組1吸光度；A2為對(duì)照組2吸光度；Ax為樣品組吸光度。

1.3.3 藍(lán)莓多糖抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 培養(yǎng)基的制備

細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂15～20g，水1000mL，pH7.0～7.2；霉菌培養(yǎng)基：馬鈴薯(切碎成塊)200g、葡萄糖20g、瓊脂15～20g，水1000mL，pH值自然；酵母菌培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏10g、瓊脂15～20g，水1000mL，pH值自然。

1.3.3.2 供試菌種的活化及菌懸液的制備

預(yù)先將7種供試菌種接入相對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，細(xì)菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，真菌置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。然后分別挑取1環(huán)已活化好的菌種放入9mL無(wú)菌水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度約為106～108CFU/mL，備用。

1.3.3.3 最小抑制濃度(MIC)的測(cè)定[14]

采用菌落直接觀察法和瓊脂擴(kuò)散濾紙片法。

菌落直接觀察法：無(wú)菌條件下，向平皿中分別移取不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓多糖稀釋液各1.0mL，再分別移取各菌懸液0.2mL，然后倒入相應(yīng)溫度在55℃左右的固體培養(yǎng)基(每次實(shí)驗(yàn)平皿中培養(yǎng)基倒入量應(yīng)保持一致)，充分混勻，待其冷卻凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在適宜的溫度下培養(yǎng)，每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)重復(fù)。取出，觀察，以不長(zhǎng)菌的最低質(zhì)量濃度為最小抑制濃度。

瓊脂擴(kuò)散濾紙片法：將定性濾紙加工成9mm的圓形濾紙片，放入干燥的平皿中，121℃干熱滅菌20min后，浸入不同質(zhì)量濃度的藍(lán)莓多糖供試液，使其充分吸收，備用。將已滅菌的固體培養(yǎng)基熔化后倒入平皿中，待冷卻凝固后，用取液器分別加入0.4mL供試菌，然后用無(wú)菌涂布器涂布均勻，用無(wú)菌鑷子夾取浸泡處理過(guò)的濾紙片貼在上述含菌平皿中，每一濃度的濾紙片間隔一定距離，并以浸泡過(guò)無(wú)菌水的濾紙片作為對(duì)照。每個(gè)平皿貼5片，每一種菌種做3個(gè)重復(fù)。然后將各平皿倒置于適宜溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。取出，測(cè)量抑菌圈的直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓多糖樣品的制備

利用水提醇沉法從藍(lán)莓中提取多糖，再經(jīng)初步純化后得到藍(lán)莓多糖樣品，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描見圖1。

圖1 藍(lán)莓多糖全波長(zhǎng)掃描Fig.1 Full wavelength scanning spectrum of blueberry polysaccharides

從圖1可知，藍(lán)莓多糖樣品在280、260nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收，表明其不含蛋白、多肽及核酸。在520nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收，表明其不含花色苷等色素類物質(zhì)。

2.2 藍(lán)莓多糖對(duì)·OH清除作用的測(cè)定

·OH被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的自由基，也是毒性最大的自由基，輻射損傷等物理、化學(xué)因子都會(huì)促進(jìn)其形成，是造成生物有機(jī)體過(guò)氧化損傷的主要因素。有研究表明，·OH是通過(guò)H2O2與金屬離子氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的，因此可以通過(guò)螯合金屬離子或使金屬離子無(wú)反應(yīng)來(lái)清除·OH[15]。VC為已知的·OH清除劑，因此以VC為對(duì)照品和藍(lán)莓多糖進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 藍(lán)莓多糖和VC對(duì)·OH 清除作用的比較Fig.2 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity between blueberry polysaccharides and VC

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，藍(lán)莓多糖與對(duì)照品VC對(duì)·OH都有較強(qiáng)的清除作用，清除率隨著二者的質(zhì)量濃度增加而提高。研究結(jié)果還表明，質(zhì)量濃度0～1mg/mL范圍內(nèi)，二者對(duì)·OH的清除作用相差不大；質(zhì)量濃度0～5mg/mL范圍內(nèi)，二者對(duì)·OH的清除作用隨質(zhì)量濃度的增加迅速提高；質(zhì)量濃度1～25mg/mL范圍內(nèi)，藍(lán)莓多糖的作用效果明顯大于對(duì)照品VC。對(duì)照品VC對(duì)清除·OH 50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50為5mg/mL，而藍(lán)莓多糖的IC50為2mg/mL。

2.3 藍(lán)莓多糖對(duì)O2·清除作用的測(cè)定

O2·是生物體內(nèi)第一個(gè)氧自由基，是其他活性氧的前體，對(duì)生物體內(nèi)細(xì)胞、酶、DNA及不飽和脂肪酸等物質(zhì)均能產(chǎn)生影響。以VC為對(duì)照品，比較二者對(duì)O2·的清除作用。以清除率和質(zhì)量濃度為橫縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖3。

圖3 藍(lán)莓多糖和VC對(duì)O2·清除作用的比較Fig.3 Comparison of superoxide anion radical scavenging capacity between blueberry polysaccharides and VC

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對(duì)照品VC對(duì)O2·有較強(qiáng)的清除作用，而藍(lán)莓多糖對(duì)O2·幾乎沒有作用效果。

2.4 藍(lán)莓多糖對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定

圖4 藍(lán)莓多糖和VC對(duì)DPPH自由基清除作用的比較Fig.4 Comparison of DPPH radical scavenging capaciy between blueberry polysaccharides and VC

清除DPPH自由基的能力可以用來(lái)衡量天然抗氧化劑的抗氧化活性。自由基清除劑對(duì)DPPH自由基的清除程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，也就是說(shuō)和抗氧化劑的供氫能力有關(guān)[16]。圖4結(jié)果表明，VC對(duì)DPPH自由基有很強(qiáng)的清除作用，0.1mg/mL的VC清除率即可達(dá)到90%以上。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，藍(lán)莓多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而提高。質(zhì)量濃度0～1mg/mL范圍內(nèi)，藍(lán)莓多糖對(duì)DPPH自由基的清除率迅速提高；質(zhì)量濃度1～4mg/mL范圍內(nèi)，清除率呈現(xiàn)平穩(wěn)提升的趨勢(shì)；質(zhì)量濃度4～12mg/mL范圍內(nèi)，清除率再次迅速提高。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可求得藍(lán)莓多糖對(duì)DPPH自由基 50%清除所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50為7mg/mL。

2.5 藍(lán)莓多糖的MIC測(cè)定

表1 菌落生長(zhǎng)情況Table 1 Growth situation of different microorganisms in the presence of blueberry polysaccharides

表2 藍(lán)莓多糖對(duì)各菌種的抑菌圈直徑Table 2 Inhibitory zone diameters of blueberry polysaccharides against different microorganisms mm

由表1、2可知，藍(lán)莓多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母均有一定的抑制效果，且作用相當(dāng)；隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)；最小抑制濃度MIC在50～75mg/mL之間。藍(lán)莓多糖對(duì)啤酒酵母有較好的抑制效果，而對(duì)熱帶假絲酵母無(wú)抑制作用，這說(shuō)明藍(lán)莓多糖對(duì)酵母的抑制具有選擇性。同時(shí)，藍(lán)莓多糖對(duì)青霉和黑曲霉也沒有抑制作用。

3 結(jié) 論

3.1 藍(lán)莓多糖的抗氧化性

藍(lán)莓多糖對(duì)·OH和DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而提高，且清除率50%所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度IC50分別為2mg/mL和7mg/mL。尤其值得注意的是，藍(lán)莓多糖對(duì)·OH的清除作用明顯強(qiáng)于VC。但藍(lán)莓多糖對(duì)幾乎沒有作用效果。多糖在生物體內(nèi)發(fā)揮作用更為復(fù)雜，它可能直接參與猝滅自由基的途徑外，還可能與通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑的活性相關(guān)[17]。因此，藍(lán)莓多糖的體內(nèi)生物功效仍需進(jìn)一步探索。

3.2 藍(lán)莓多糖的抑菌作用

多糖對(duì)各類微生物的生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，或者說(shuō)生長(zhǎng)拮抗。但多糖抑菌作用的機(jī)制還不十分明確。實(shí)驗(yàn)表明，藍(lán)莓多糖的抑菌作用還是相對(duì)較弱的。對(duì)常見的細(xì)菌有一定的抑制作用，對(duì)酵母的抑制作用具有選擇性，對(duì)供試的兩種常見的霉菌沒有抑制效果。對(duì)同一菌株而言，抑菌效果隨多糖質(zhì)量濃度的增大而顯著。藍(lán)莓多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母的最小抑制濃度MIC在50～75mg/mL之間。由于菌種所限，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)常見的7種菌進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，因此藍(lán)莓多糖對(duì)其他菌種的抑制作用還有待研究。

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Antioxidant and Antimicrobial Activities of Blueberry Polysaccharides

MENG Xian-jun，LIU Xiao-jing，SUN Xi-yun，ZHANG Qi，PAN Xuan
(College of Food, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

TQ929.2

A

1002-6630(2010)17-0110-05

2010-04-01

孟憲軍(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣哔A藏與加工。E-mail：mengxjsy@126.com