動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)制備色譜分離丹參脂溶性單體化合物

朱 靖 博， 費(fèi) 雅 君， 王 妍 妍， 郭 秀 潔

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是一種多年生草本植物，為唇形科鼠尾草屬，其干燥根及根莖是中醫(yī)常用的一味歷史悠久的活血化瘀藥[1]。丹參的主要藥效成分為脂溶性二萜類化合物和以丹酚酸為主的水溶性多酚類化合物[2-3]。其中丹參脂溶性單體已被證明具有保護(hù)心血管系統(tǒng)[4]、抗炎[5-6]、抗菌[7]等作用，在藥理研究及新藥開(kāi)發(fā)等方面具有極高的實(shí)用價(jià)值。

目前，對(duì)于丹參脂溶性系列化合物的分離，在實(shí)驗(yàn)室水平有所突破，已分離得到40余種單體化合物[2]，但大多工藝復(fù)雜，且生產(chǎn)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大量人力、物力。本文旨在采用動(dòng)態(tài)軸向工業(yè)制備色譜技術(shù)建立丹參脂溶性單體的工業(yè)色譜分離工藝，實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，促進(jìn)丹參藥物的現(xiàn)代化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

材料與試劑：丹參藥材(天津天士力丹參基地——陜西商洛)；丹酚酸B、丹參素、丹參酮ⅡA及隱丹參酮對(duì)照品(實(shí)驗(yàn)室自制)；柱層析硅膠，H60薄層層析用(青島海洋)；乙腈為色譜純(美國(guó)TEDIA)；雙蒸去離子水(實(shí)驗(yàn)室自制)；柱層析用二氯甲烷、石油醚為工業(yè)純，其他試劑均為市售分析純。

儀器：動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜系統(tǒng)DAC250系統(tǒng)(φ250 mm×1 000 mm，大連博邁科技發(fā)展有限公司)，DAC150系統(tǒng)(φ150 mm ×1 000 mm，大連博邁科技發(fā)展有限公司)。UltiMate 3000型分析型高效液相色譜儀(美國(guó)戴安)；UPLC-QTOF-MS (美國(guó)Waters公司)；SK250H型超聲清洗器(上海科導(dǎo))；ZF-1三用紫外分析儀(上海精科)。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品液的制備

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱量對(duì)照品丹參酮ⅡA4.6 mg、隱丹參酮2.1 mg、丹酚酸B 8.1 mg和丹參素4.4 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.46、0.21、0.81、0.44 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

樣品溶液制備：各種提取物均配制為相當(dāng)生藥50 mg/mL的甲醇溶液。

1.2.2 丹參提取物的HPLC定量分析

色譜條件：色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Sinochrom ODS-BP；流動(dòng)相：A為含0.02%磷酸的乙腈，B為含0.02%磷酸的水溶液，進(jìn)行梯度洗脫，具體方法見(jiàn)表1；體積流量，1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)，270 nm；進(jìn)樣量，20 μL。

表1 HPLC分析中流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab.1 Gradient program of mobile phase for HPLC analysis

1.2.3 丹參脂溶性化合物的TLC定性分析

用玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管將樣品液點(diǎn)在薄層硅膠板上，待板上樣點(diǎn)干后，將板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中上行展開(kāi)，展距80 mm，取出，吹干，紫外燈254 nm下觀測(cè)，計(jì)算斑點(diǎn)Rf值。

1.2.4 丹參酮單體的UPLC-QTOF-MS分析

UPLC分析條件：Waters ACGITYTMUPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈和水為流動(dòng)相，體積比為60∶40，等度洗脫。

QTOF-MS分析條件：氮?dú)庾鳛閲婌F與輔助氣態(tài)，氬氣作為碰撞氣。ESI毛細(xì)管電壓為2.5 kV，離子源和脫溶劑溫度分別為120和350 ℃。掃描范圍：m/z100～1 000 u。

1.3 分離純化方法

1.3.1 丹參脂溶性化合物提取溶劑的選擇

稱取丹參生藥粉(40 目)5 g，分別加入一定體積的9 種不同溶劑，40 ℃下超聲提取30 min，過(guò)濾、濃縮提取液，將各提取物定容，最終配制成相當(dāng)于生藥質(zhì)量濃度為50 mg/mL的樣品液，進(jìn)HPLC分析；以提取物中某成分的質(zhì)量濃度折算成原植物的含量，并用下述公式計(jì)算并比較提取率。

w(活性成分A)=C標(biāo)iSiVi/miS標(biāo)i

式中，w為活性成分A的提取率，mg/g；i為丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸B以及丹參素；C標(biāo)i為成分i的對(duì)照品質(zhì)量濃度，mg/mL；Si為樣品中成分i的色譜峰面積，mAU·min；mi為原料質(zhì)量，mg；S標(biāo)i為成分i對(duì)照品峰面積，mAU·min；Vi為提取物定容體積，mL。

1.3.2 柱層析流動(dòng)相的選擇

根據(jù)色譜分離溶劑選擇的“三角形法則”和某些溶劑的分離特性，選用丙酮、苯、乙酸乙酯、二氯甲烷與環(huán)己烷適當(dāng)配比，對(duì)樣品液進(jìn)行單向展開(kāi)。以點(diǎn)數(shù)、分離度、拖尾現(xiàn)象作為柱色譜分離能力的判斷指標(biāo)，對(duì)分離溶劑系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)、篩選。

1.3.3 丹參脂溶性單體的分離

采用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱，以硅膠為填料分離制備丹參脂溶性單體。將一定量的硅膠干法裝入動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱中，用石油醚平衡后，以15.68 GPa的壓力軸向壓縮柱床。用適宜的方法將丹參的脂溶性組分上樣，用合適的流動(dòng)相以300 mL/min的體積流量進(jìn)行梯度洗脫，每3 L收集一次，TLC跟蹤檢測(cè)合并色譜帶相同組分。當(dāng) TLC檢測(cè)不到樣品或含量極微時(shí)，更換洗脫液比例。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

丹參中有兩類主要活性物質(zhì)，分別是水溶性的丹酚酸類和脂溶性的丹參酮類化合物。選擇適宜的溶劑，盡可能降低提取丹參酮類化合物時(shí)酚酸類化合物的滲出，對(duì)于后期丹參酮類化合物的分離十分有利。HPLC分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取溶劑提取物主要成分分析Tab.2 Content of different solvens extract

由表2可知，所選溶劑對(duì)丹參酮ⅡA、隱丹參酮均表現(xiàn)出一定的提取效果，其中以二氯甲烷溶劑單位提取量最高，且其對(duì)丹酚酸B和丹參素的提取量未檢出，因此選擇二氯甲烷作為提取溶劑。

2.2 薄層色譜及柱色譜流動(dòng)相的選擇

選擇薄層色譜展開(kāi)系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)使樣品在TLC板上全程展開(kāi)，目標(biāo)化合物的Rf值在0.2～0.8[9]。表3給出了4種溶劑系統(tǒng)不同比例下的展開(kāi)效果。結(jié)果表明，各系統(tǒng)對(duì)丹參脂溶性成分均有分離作用。其中在石油醚-乙酸乙酯體系中，薄層展開(kāi)后可見(jiàn)6個(gè)斑點(diǎn)，較優(yōu)于其他體系，但該體系有明顯拖尾現(xiàn)象，這可能與石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)對(duì)丹參脂溶性化合物的溶解性差有關(guān)。綜上，最終選擇分離度好、不脫尾的石油醚-二氯甲烷系統(tǒng)作為柱層析的流動(dòng)相。柱色譜分離的流動(dòng)相極性應(yīng)比TLC檢測(cè)條件極性小，目標(biāo)化合物Rf值在0.1～0.3[10]。根據(jù)所建立的薄層色譜檢測(cè)條件，調(diào)整石油醚-二氯甲烷體系的比例，降低Rf值，最終選擇V(石油醚)∶V(二氯甲烷)=10∶1作為柱色譜分離時(shí)初始流動(dòng)相的比例。

表3 不同展開(kāi)劑的TLC分離結(jié)果Tab.3 The TLC results with various mobile phase

2.3 單體化合物分離

粉碎的丹參100 kg，充分干燥后，以4倍量二氯甲烷加熱提取3次，濃縮提取液至一定體積，拌入1.5倍的硅膠，裝入色譜預(yù)柱后串聯(lián)于φ250 mm×1 000 mm動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱，分別以石油醚-二氯甲烷[V(石油醚) ∶V(二氯甲烷)=10∶1、8∶1、6∶1、3∶1、1∶1]和純石油醚，以體積流量300 mL/min梯度洗脫，TLC檢測(cè)共合并得到譜帶相同的組分A、B、C、D 4段流分(HPLC結(jié)果見(jiàn)圖1)。其中A段物質(zhì)主要為丹參酮ⅡA前端的前雜物質(zhì)，不作分離處理；B、C 2段物質(zhì)則以丹參酮ⅡA為主，在精分中作合并處理，D段物質(zhì)主要為隱丹參酮。

B-C段分離：將395 g B-C段用二氯甲烷溶解上樣于φ150 mm×1 000 mm柱，以石油醚-二氯甲烷[V(石油醚)∶V(二氯甲烷)=10∶1、8∶1、6∶1]和純二氯甲烷梯度洗脫，經(jīng)8.8倍柱床體積溶劑洗脫，TLC跟蹤合并得到BC-1、BC-2、BC-3、BC-4 4個(gè)組分，其中BC-2、BC-3、BC-4 TLC檢測(cè)為單點(diǎn)。

圖1 一級(jí)柱層析A、B、C、D 4段流分的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of A, B, C, D fraction from primary column chromatograph

D段分離：分離裝置同B-C段。將315 g樣品用二氯甲烷溶解上柱，以V(石油醚)∶V(二氯甲烷)=5∶1、4∶1、3∶1和純二氯甲烷梯度洗脫，3 L為一份進(jìn)行收集。經(jīng)過(guò)6.2個(gè)柱床體積的洗脫，TLC跟蹤合并得到D-1、D-2、D-3 3個(gè)組分，其中D-2 TLC檢測(cè)為單點(diǎn)。

2.4 結(jié) 晶

將BC-2、BC-3、BC-4、D-2 4部分溶液分別在低于45 ℃下減壓濃縮至干，加少量二氯甲烷溶液結(jié)晶，得到晶體BC-2(141.5 g)、BC-3(8.2 g)、BC-4(12.5 g)和D-2(73.2 g)。

2.5 化合物鑒定

BC-2，鮮紅色針狀結(jié)晶(二氯甲烷)，UVλmax(MeOH)=223.4、253.4、268.8 nm。HPLC鑒定表明其保留時(shí)間、紫外吸收與丹參酮ⅡA一致。與文獻(xiàn)[11]比較，可確定該化合物為丹參酮ⅡA，HPLC測(cè)定相對(duì)純度為98.5%。

BC-3，黑紫色細(xì)柱狀結(jié)晶(二氯甲烷)，UVλmax(MeOH)=226.1、291.1 nm，UPLC-QTOF-MS 分析正離子[M+H]+=279，說(shuō)明其相對(duì)分子質(zhì)量為278，將其光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)照，與1，2-二氫丹參醌相似，尚需進(jìn)行13C NMR、1H NMR進(jìn)一步確定。HPLC測(cè)定其相對(duì)純度為95.4%。

BC-4，棕紅色針狀結(jié)晶(二氯甲烷)，UVλmax(MeOH)=245.7、267.1、323.7 nm，UPLC-QTOF-MS 正離子[M+H]+=277，將其質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11,13-14]對(duì)照，確定BC-4為丹參酮Ⅰ，HPLC測(cè)定相對(duì)純度為96.2%。

D-2，橙紅色針狀結(jié)晶(二氯甲烷)，UVλmax(MeOH)=219.2、264.2、292.2 nm，HPLC鑒定表明其保留時(shí)間、紫外吸收與隱丹參酮一致，并與文獻(xiàn)[11]對(duì)照，確定該化合物為隱丹參酮，HPLC測(cè)定相對(duì)純度為97.8%。

3 結(jié) 論

高純度單體化合物的制備已成為藥物制備、生物活性及ADME(藥物吸收、分布、代謝和排泄)系統(tǒng)評(píng)價(jià)優(yōu)化等研究?jī)?nèi)容中最基礎(chǔ)的工作。工業(yè)制備色譜正是適應(yīng)科技與生產(chǎn)需要發(fā)展起來(lái)的一種高效的分離手段。本文通過(guò)HPLC優(yōu)選提取溶劑，并結(jié)合TLC實(shí)驗(yàn)篩選得到合適的展開(kāi)劑以及柱色譜分離條件，將結(jié)果直接放大到動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱制備分離中，建立了應(yīng)用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱分離高純度丹參脂溶性單體化合物的分離工藝。結(jié)果表明，應(yīng)用動(dòng)態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜柱分離丹參脂溶性單體化合物，分離操作工藝簡(jiǎn)單、易實(shí)施，分離周期短、效率高，對(duì)于天然活性成分單體的制備具有重要意義。

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