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    一種嗜堿菌微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸的條件優(yōu)化

    2010-09-26 01:17:46偉,晶,志,權(quán)
    關(guān)鍵詞:毛細管氮源菌體

    楊 大 偉, 田 晶, 苑 廣 志, 徐 龍 權(quán)

    ( 大連工業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代教育技術(shù)部, 遼寧 大連 116034 )

    0 引 言

    乳酸是重要的生物化工產(chǎn)品,廣泛用于醫(yī)藥、食品、飲料、日用化工、石油化工、皮革、卷煙工業(yè)等領(lǐng)域[1]。特別是近年來開發(fā)出的L-乳酸的聚合物,可生產(chǎn)生物降解的農(nóng)用地膜及其他塑料制品代替無法降解的常用塑料,能解決全球的“白色”污染問題[1],因而乳酸有廣闊的國內(nèi)外市場。

    目前乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法[2]、酶法[3]和發(fā)酵法[4]?;瘜W(xué)合成法所用的原料是乙醛和劇毒物質(zhì)氫氰酸,生產(chǎn)成本也較高,因而該法生產(chǎn)乳酸受到極大地限制。酶法生產(chǎn)乳酸雖然可以專一性得到旋光乳酸,但工藝比較復(fù)雜,應(yīng)用于工業(yè)還有待于進一步研究。微生物發(fā)酵法可通過菌種和培養(yǎng)條件的選擇而得到具有專一性的D-乳酸、L-乳酸或是DL-乳酸[5-6],且乳酸菌具有發(fā)酵溫度高、產(chǎn)酸率相對較高、對糖利用率高、發(fā)酵時不需通氧氣等優(yōu)點,因此發(fā)酵法具有非常廣闊的前景[7-9]。

    作者從14株嗜堿菌中篩選出一株性能優(yōu)良的產(chǎn)乳酸菌,并對該菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件做了初步研究,以期為極端微生物的進一步開發(fā)利用提供一些有價值的參考。

    1 材料和方法

    1.1 材料和菌種

    14種嗜堿菌F1-2、F1-5、F27-4、288、289、CG、Tc10、SH1、SH2、XH2、LP3-1、LP3-2、LP3-3、LP3-4,中科院微生物研究所極端環(huán)境微生物組菌種保藏中心提供;P/ACE MDQ 毛細管電泳儀(Beckman公司,美國);TJL-16G臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;THZ-82(A) 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器,江蘇省金壇市榮華儀器制作有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技; UV2450紫外分光光度計,日本島津公司;所用試劑均為分析純。

    1.2 乳酸產(chǎn)生菌的篩選

    將14株嗜堿菌接種到平板篩選培養(yǎng)基進行初篩。初篩得到的幾株菌經(jīng)種子培養(yǎng)基活化兩代后,按10%接種量將各株菌接種到裝液量為30 mL的100 mL三角瓶中,采用篩選培養(yǎng)基,35 ℃,200 r/min,通氣恒溫振蕩培養(yǎng)36~72 h,并定期取發(fā)酵液檢測其產(chǎn)生乳酸的量及OD值,篩選出一株性能優(yōu)良的乳酸菌。將篩選到的乳酸菌接種于20 mL種子培養(yǎng)基,于35 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h;取出5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50 mL培養(yǎng)基中,于35 ℃培養(yǎng)16 h后轉(zhuǎn)接入250 mL種子培養(yǎng)基中。在35 ℃條件下,每隔2 h取樣,用0.85%的氯化鈉溶液稀釋20倍,并以各瓶離心去除菌體后稀釋相同倍數(shù)種子液作為空白對照,測定OD600值。

    1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

    對培養(yǎng)基中碳源、氮源及碳氮比進行了選擇及優(yōu)化。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20.0 g,胰蛋白胨2.0 g,酵母膏10.0 g,牛肉膏3.0 g,無水乙酸鈉2.0 g, 檸檬酸三銨 2.0 g,K2HPO4·H2O 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnCl2·4H2O 0.06 g,NaCl 40 g,吐溫80 1 mL,酚紅5%,pH=9.0,去離子水1 L)的基礎(chǔ)上,分別以葡萄糖、麥芽糖、淀粉、乳糖、木糖、果糖作為碳源,用量為2%;以酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硝酸銨、硫酸銨作為氮源,用量為0.5%。斜面菌種經(jīng)種子培養(yǎng)基活化16 h后,按5%接種量轉(zhuǎn)接入50 mL培養(yǎng)基中,于35 ℃、200 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)48 h,定期取樣品測定OD600值及乳酸的產(chǎn)量。對所選氮源調(diào)整用量分別為0.5%、1%、1.5%,確定最佳用量;對所選碳源、氮源的比值分別采用1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1,確定最佳碳氮比。

    1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

    分別考察接種量、初始pH值、溫度、裝液量等條件對乳酸產(chǎn)量的影響,并進行優(yōu)化。接種量分別為1%、3%、5%、8%、10%,初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,采用35 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h,定期取樣品測定OD600值及乳酸的產(chǎn)量;考察了培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40 ℃時菌株的發(fā)酵情況;調(diào)整250 mL三角瓶裝液量,分別為30、50、80、125 mL進行培養(yǎng),同時對125 mL裝液量的菌體在培養(yǎng)時采用12 h好氧和整個培養(yǎng)期間全封閉式培養(yǎng)。

    將菌種經(jīng)種子培養(yǎng)基活化16 h后,轉(zhuǎn)接入優(yōu)化后的培養(yǎng)基,采用優(yōu)化的條件發(fā)酵48 h,期間每隔2 h取樣檢測發(fā)酵液的OD600值、pH值和乳酸產(chǎn)生量,繪制菌株的生長曲線及產(chǎn)物生成曲線。

    1.5 發(fā)酵液乳酸的毛細管電泳檢測

    1.5.1 毛細管電泳的操作條件

    P/ACE MDQ 毛細管電泳儀,熔融石英毛細柱(37 cm×50 μm I.D)。分離電壓,負電壓,8 kV;進樣壓力,3.4 kPa,時間6 s;柱溫,25 ℃;紫外檢測波長,200 nm;進樣量,100 μL。

    1.5.2 毛細管電泳檢測方法

    配制0.2~4.0 mg/mL系列乳酸標準溶液,在“1.5.1”所述電泳條件下依次進行分析,得到乳酸的標準曲線。在相同的電泳條件下測定發(fā)酵液中乳酸的含量。

    將實際發(fā)酵液在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,上清液經(jīng)0.22 μm針筒式水膜過濾器過濾,稀釋一定倍數(shù)后取樣100 μL進行檢測。每個樣品重復(fù)測定3次。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 乳酸產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

    出發(fā)菌株的初篩結(jié)果列于表1中。從表1可以看出,在14株菌中,289、SH1和LP3-3生長和產(chǎn)酸情況明顯好于其他菌株;其中SH1生長情況最好,LP3-3產(chǎn)酸最多。因此選擇289、SH1和LP3-3進行復(fù)篩。

    表1 各株菌在篩選平板上的生長及產(chǎn)酸情況Tab.1 Growth and yield of acids at preliminary screening

    289、SH1和LP3-3復(fù)篩結(jié)果見圖1。289、SH1和LP3-3 3菌株發(fā)酵24 h時乳酸產(chǎn)量相差不大;34 h時289、SH1兩株菌的乳酸產(chǎn)量基本沒有增長,而LP3-3的乳酸產(chǎn)量明顯高于其他兩株菌,說明LP3-3進入衰老期較晚,更易提高產(chǎn)酸量。因此選擇LP3-3作為出發(fā)菌株。

    圖1 289、SH1和LP3-3三株菌復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Yield of acids at screening of 289, SH1 and LP3-3

    2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化結(jié)果

    通過考察培養(yǎng)基中碳源、氮源種類、濃度以及碳氮比對發(fā)酵過程乳酸產(chǎn)量的影響,確定葡萄糖為最佳碳源,酵母膏為氮源,添加質(zhì)量分數(shù)為0.2%的蛋白胨做輔助氮源,氮源質(zhì)量分數(shù)為1%,碳氮比為5∶1(見圖2~5)。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖50.0,胰蛋白胨2.0,酵母膏10.0,蛋白胨 2.0,無水乙酸鈉2.0,檸檬酸三銨2.0,K2HPO4·H2O 2.0,MgSO4·7H2O 0.2,MnCl2·4H2O 0.05,NaCl 40,吐溫80 1 mL。用10%的NaHCO3調(diào)節(jié)pH,初始pH為9.0。

    G,葡萄糖; M,麥芽糖;St,淀粉;L,乳糖;X,木糖;F,果糖

    2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

    接種量小于5%時,隨著接種量的增加,產(chǎn)生的乳酸量也相應(yīng)增加,但當接種量超過5%后,乳酸量反而下降,因此采用接種量為5%。隨著初始pH值的增加,菌體的生長速率逐漸變快,而初始pH 6~8時,菌體只有少量生長,且乳酸產(chǎn)量也較少;初始pH為9、10、11的發(fā)酵液中的乳酸量相對較多,其中pH=9時乳酸產(chǎn)量最高,因此選擇初始pH值為9。通過考察不同溫度時的發(fā)酵情況,確定35 ℃作為發(fā)酵溫度,種子培養(yǎng)溫度為30 ℃,發(fā)酵時用密封發(fā)酵較好,且宜采用125 mL裝液量250 mL搖瓶發(fā)酵。

    U,尿素;N,硝酸銨;S,硫酸銨;Pr,蛋白胨;B,牛肉膏;Y,酵母膏

    圖4 氮源質(zhì)量分數(shù)對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of concentration of nitrogen sources on lactic acid production

    圖5 碳氮比對乳酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of proportion of carbon and nitrogen on lactic acid production

    利用最佳發(fā)酵條件和優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵42 h得到菌株生長曲線及產(chǎn)物生成曲線。從圖6看,0~4 h為延滯期,4~20 h為菌體的對數(shù)生長期,其后為穩(wěn)定期,直至42 h開始衰亡。菌體生長過程中伴隨乳酸的產(chǎn)生,在菌體數(shù)量達到穩(wěn)定,即20 h左右,乳酸仍然在緩慢增加,直至38 h左右達到峰值,說明菌體在先完成自身生長之后才開始大量積累乳酸,這與前面的結(jié)論是一致的。從圖7看,在0~24 h,pH值變化較大,隨著乳酸的增加pH值逐漸降低,但變化較緩,主要是由培養(yǎng)基中NaHCO3的緩沖作用引起的。從菌體生長情況也可看出該菌的生長pH值范圍較寬,但最適仍為9.0。

    圖6 LP3-3菌株生長曲線Fig.6 Growth curve of LP3-3

    圖7 產(chǎn)物生成及pH變化曲線Fig.7 Curve of pH and lactic acid production

    2.4 毛細管電泳檢測結(jié)果

    乳酸的線性范圍為0.2~4.0 mg/mL,峰面積(A)與質(zhì)量濃度(C)之間的線性關(guān)系為A=25 649C+1 147.2,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 4,檢出限為0.1 mg/mL,遷移時間相對標準偏差為0.24%,峰面積相對標準偏差為2.11%,樣品加標回收率為102.3%(n=4),LP3-3菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸的測定結(jié)果如表2所示。

    2.5 菌株的初步鑒定

    對篩選到的菌株進行了初步鑒定,LP3-3經(jīng)16S rRNA序列測定初步鑒定為Exiguobacteriumaurantiacum。

    表2 LP3-3菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸的測定結(jié)果Tab.2 Concentration of lactic acid produced by fermentation of LP3-3

    3 結(jié) 論

    從14株耐堿菌中篩選到一株LP3-3產(chǎn)乳酸能力較強,對該菌株進行乳酸發(fā)酵優(yōu)化后,確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成及搖瓶發(fā)酵最佳條件。采用毛細管電泳檢測發(fā)酵液中乳酸的含量, 出發(fā)菌株乳酸產(chǎn)量為10.02 g/L,在最佳發(fā)酵條件下乳酸產(chǎn)量為16.27 g/L,比原來提高62.4%,達到了較好的效果。本研究可為極端微生物在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸等生物基產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

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