CUL5基因沉默對連續(xù)照射期間CNE2細胞增殖狀況影響的研究

朱小東 李燁 曲頌 李齡 黎丹戎 張瑋

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，*第六實驗室，廣西 南寧 530021

鼻咽癌常規(guī)分割放射治療期間存在的腫瘤細胞加速再增殖現(xiàn)象是導(dǎo)致鼻咽癌治療失敗的重要原因之一，但其機制未明。有研究證實，細胞受照射后其增殖活性的改變與細胞周期基因有關(guān)［1］。本研究已在前期應(yīng)用基因芯片技術(shù)、實時熒光定量PCR篩選出與照射后鼻咽低分化鱗癌細胞（CNE2）增殖狀態(tài)相關(guān)的差異基因，其中CUL5為細胞增殖活性增高時的上調(diào)基因之一［2］。本研究通過離體細胞實驗的方法，采用RNA干擾技術(shù)探索CUL5表達情況對鼻咽癌放射治療中細胞增殖活性的影響，初步探索鼻咽癌放射治療中細胞加速增殖的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒（上海吉瑪公司）；鼻咽低分化鱗癌細胞株CNE2及感受態(tài)DH5α均由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ，PstⅠ，BbsⅠ）及T4 DNA連接酶（TakaRa公司）；lambda/Eco130I marker（MBI公司）；質(zhì)粒小量抽提試劑盒（Omega Bio-tek公司）；膠回收試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；Trizol（Invitrogen公司）、LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI公司）；G418、四甲基偶氮唑藍（MTT）（Sigma公司）；Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CNE2細胞加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下培養(yǎng)，常規(guī)傳代，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 寡核苷酸的設(shè)計合成 根據(jù) Genebank中CUL5的序列，按照Tuschl 設(shè)計原則［3］由吉瑪公司設(shè)計合成3對siRNA序列（表1），贈送一對通用陰性對照（negative control，NC）序列。用LipofectamineTM2000將以上序列瞬時轉(zhuǎn)染CNE2細胞，48 h后提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行CUL5基因的PCR擴增（上游引物序列：5’-AATGGCATAGGCACCTTGTC-3’；下游引物序列：5’-GGGAATGAACAGCAGCAAAT-3’，產(chǎn)物長度130 bp），以β-actin為內(nèi)參（上游引物序列：5’-GATGACCCAGATCATGTTTG-3’；下游引物序列：5’-TGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3’，產(chǎn)物長度491 bp），根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析所得CUL5灰度比值篩選出沉默效果最好的siRNA序列，此序列按照表達質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo的要求，設(shè)計寡核苷酸序列。CUL5正義鏈：5’-CACCGACACGACGTCTTATATTATTCAAGAGATAATATAAGACGTCGTGTCTTTTTTG-3’；反義鏈：5’-GATCCAAAAAAGACACGACGTCTTATATTATCTCTTGAATAATATAAGACGTCGTGTC-3’。由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 siRNA靶位及序列Tab.1 Targets and sequences of siRNA

1.2.3 重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5的構(gòu)建及鑒定 將合成的DNA oligo退火處理所得shRNA模板通過T4 DNA連接酶與pGPU6/GFP/Neo載體雙酶切（BamHⅠ+BbsⅠ）后膠回收所得線性化空載體進行連接。連接產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化、篩選及限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、PstⅠ分別酶切鑒定，對可能重組成功的質(zhì)粒，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行DNA測序鑒定以進一步證實。

1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及細胞克隆篩選 用LipofectamineTM2000將重組干擾質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5轉(zhuǎn)入CNE2細胞中，設(shè)為實驗組（稱為pGPU6/GFP/Neo-CUL5組）。同時設(shè)通用陰性對照重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-NC轉(zhuǎn)染CNE2細胞的陰性對照組（pGPU6/GFP/Neo-NC組）及未轉(zhuǎn)染的空白對照組（CNE2組）。轉(zhuǎn)染48 h后，用含G418（篩選濃度300 μg/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d至抗性克隆出現(xiàn)，采用有限稀釋法獲取G418抗性單克隆，并以G418維持濃度（150 μg/mL）擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定傳代的陽性細胞。

1.2.560Co-γ射線照射 使用60鈷遠距離治療機照射細胞，劑量率為108～111 cGy/min，放射源到細胞的距離為80 cm，機頭和機架角度均為0°，調(diào)整細胞上方RPMI 1640 培養(yǎng)液（含10%小牛血清）的深度為5 mm，以此作為60Co-γ射線照射所需劑量建成區(qū)，照射野面積為30 cm×30 cm，且照射細胞擺放位置均位于照射野邊緣2 cm以內(nèi)的區(qū)域。2 Gy/d，每天1次，連續(xù)照射5 d。

1.2.6 RT-PCR檢測60Co-γ照射前、后陽性細胞CUL5基因mRNA表達水平 取未經(jīng)照射及連續(xù)分割照射第1、3、5天的細胞，培養(yǎng)24 h后，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行CUL5基因的PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析CUL5的灰度比值，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 MTT法測連續(xù)照射期間陽性細胞相對增殖率 將單細胞懸液以每孔1×103個細胞接種于96孔板中進行細胞培養(yǎng)及照射。分別于照射第1～5天，每次照射后24 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（A值），取相同生長天數(shù)及轉(zhuǎn)染相同質(zhì)粒的A值的均值作為該組細胞某天的A值，計算照射后細胞相對增殖率。

1.2.8 流式細胞術(shù)（FCM）檢測連續(xù)照射期間陽性細胞的細胞增殖情況 將單細胞懸液以每孔1×105個細胞接種于6孔板中進行細胞培養(yǎng)及照射，分別于照射第1～5天，每次照射后24 h，胰酶消化，室溫300×g離心5 min，吸去上清液，加入1 mL緩沖液重懸細胞，重復(fù)幾次，調(diào)整細胞濃度到1×106個/mL，固定，上機檢測。具體步驟詳見Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit 說明書。

1.2.9 統(tǒng)計處理 采用SPSS 13.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA靶序列選擇 RT-PCR檢測各種轉(zhuǎn)染細胞CUL5基因的表達情況（圖1），通過凝膠電泳條帶分析結(jié)果（圖2）顯示，轉(zhuǎn)染陰性對照的細胞CUL5基因表達無明顯變化，轉(zhuǎn)染siRNA的細胞CUL5基因表達有不同程度下調(diào)，以β-actin為內(nèi)參校正，靶位699、1190、2039的灰度比分別為0.398、0.776、0.337，靶位2039的siRNA下調(diào)最明顯，可作為構(gòu)建CUL5干擾RNA真核細胞表達載體的靶點。

圖1 CUL5基因表達的電泳結(jié)果Fig.1 Expressions of CUL5 after the transfection of siRNAs

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

2.2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 酶切結(jié)果表明，所有質(zhì)粒均為陽性重組載體（圖2）。

2.2.2 重組質(zhì)粒測序鑒定 DNA序列測定結(jié)果表明，序列已成功插入質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo，載體構(gòu)建成功（圖3）。將重組質(zhì)粒命名為pGPU6/GFP/Neo-CUL5。

圖3 重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5測序圖（部分）Fig.3 Part of the sequence map of pGPU6/GFP/Neo-CUL5

2.3 未照射陽性細胞CUL5基因沉默效果RT-PCR檢測未經(jīng)照射的3組細胞CUL5基因的表達情況（圖4），通過凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶，以β-actin為內(nèi)參校正，測定CNE2組、pGPU6/GFP/Neo-NC組、pGPU6/GFP/Neo-CUL5組CUL5的灰度比分別為0.122、0.175和0.004，表明pGPU6/GFP/Neo-CUL5組的CUL5基因表達受到明顯抑制。

圖4 照射前各細胞株CUL5基因表達的電泳結(jié)果Fig.4 Expressions of CUL5 in each group before irradiation

2.4 照射后陽性細胞CUL5基因沉默效果照射第1天CNE2組、pGPU6/GFP/Neo-NC組、pGPU6/GFP/Neo-CUL5組CUL5灰度比分別為0.667、0.786和0；照射第3天分別為0.538、1.222和0；照射第5天分別為0.818、1.381和0，表明pGPU6/GFP/Neo-CUL5組在受照射后CUL5基因表達仍受到明顯抑制。

2.5 MTT法測各組細胞照射后不同時間相對增殖率 結(jié)果顯示連續(xù)照射5天期間，CNE2組及pGPU6/GFP/Neo-NC組細胞以第3天相對增殖率最高，pGPU6/GFP/Neo-CUL5組第1天相對增殖率最高，3組均以第5天最低（表2）。經(jīng)單因素方差分析，pGPU6/GFP/Neo-CUL5組與pGPU6/GFP/Neo-NC組及有CNE2組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）、pGPU6/GFP/Neo-NC組與CNE2組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.741）。

圖5 照射后各細胞株CUL5基因表達的電泳結(jié)果Fig.5 Expressions of CUL5 in each group after irradiation at the 1st, 3rd and 5th day

2.6 FCM檢測照射后細胞增殖情況 FCM通過測定細胞內(nèi)DNA含量，分析照射后pGPU6/GFP/Neo-CUL5及CNE2組細胞中處于G0、G1、S期的比例，比較其增殖能力。根據(jù)公式計算出每天的S期細胞百分率（SPF）及增殖指數(shù)（PI）值（表3、4），可知2 Gy/d連續(xù)照射期間，pGPU6/GFP/Neo-CUL5組細胞在照射第1天SPF及PI值均為最高值，說明此時細胞增殖最旺盛，而在照射第5天時，SPF及PI值均為最低值，提示此時細胞增殖活性最低，增殖速度減慢；CNE2組細胞在照射第3天SPF及PI值均為最高值，增殖活性最高，照射第5天時，SPF及PI值均為最低值，增殖速度減慢。

表2 各組細胞照射后不同時間相對增殖率Tab.2 Relative growth rate of each group after irradiation at different days

表3 照射后pGPU6/GFP/Neo-CUL5組細胞周期分布情況Tab.3 Distribution of cell cycle in cells transfected with pGPU6/GFP/Neo-CUL5 after irradiation(%)

表4 照射后CNE2組細胞周期分布情況Tab.4 Distribution of cell cycle in CNE2 after irradiation(%)

3 討 論

Hermens和Barendsen［4］研究大鼠橫紋肌肉瘤時發(fā)現(xiàn)照射1周后，腫瘤中增殖細胞比例上升，克隆細胞倍增時間由4 d縮短到1.5 d，認(rèn)為腫瘤干細胞已開始加速再增殖；本課題組前期研究［5］應(yīng)用不同的實驗方法，已明確了人鼻咽癌細胞株CNE2在連續(xù)分割照射中確實存在中后期加速再增殖現(xiàn)象，并通過基因芯片篩選出CUL5為細胞增殖活性增高時的上調(diào)基因之一，其在照射增殖活性最高時相與最低時相表達差異在2倍以上。

Singhal等［6］在檢測早期肺腺癌與正常肺組織間存在差異的細胞周期基因時首次發(fā)現(xiàn)了CUL5基因。此后，Burnatowska-Hldin等［7］和Baxter 等［8］也分別研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌T47D細胞增殖速度、急性早幼粒細胞性白血病中粒細胞系的分化和CUL5的表達存在相關(guān)性。CUL5基因編碼的Cul5支架蛋白，可介導(dǎo)蛋白酪氨酸激酶的泛素化，還與p53/TP53的降解有關(guān)［9］，其具體功能目前尚在研究之中。

本研究為了明確CUL5基因表達增強是否真與臨床觀察到的鼻咽癌細胞的增殖活性增高有關(guān)，采用RNA干擾技術(shù)沉默CUL5基因后，給予實驗組、陰性對照組、空白對照組鼻咽低分化鱗癌細胞株CNE2 2 Gy/d，連續(xù)照射5 d，并采用MTT對每天照射后的細胞進行檢測，按公式計算每次照射后細胞相對增殖率，實驗組分別為1.03±0.05、0.97±0.03、0.84±0.12、0.54±0.09、0.33±0.11，增殖速度呈下降趨勢，照射第4、5天，細胞增殖明顯減慢；陰性對照組分別為1.07±0.09、0.96±0.12、1.21±0.04、1.19±0.04、0.91±0.02，空白對照組分別為1.07±0.09、0.97±0.05、1.22±0.07、1.22±0.04、0.97±0.04，均在照射第3、4天時，細胞增殖加速，照射第5天時增殖速度減慢，這與我們［5］前期研究結(jié)果一致。實驗組與陰性及空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），提示CUL5基因沉默后，照射中后期CNE2細胞加速增殖現(xiàn)象改變，說明CUL5基因表達增強與CNE2細胞照射中后期加速增殖有關(guān)。S期細胞百分率（SPF）指正在整個細胞群體中處于S期的細胞所占的百分比，是表示細胞增殖活性的重要指標(biāo)。細胞增殖指數(shù)（PI）代表了細胞群的增殖狀態(tài)，是指細胞群各期細胞分布百分比中的DNA合成期（S期）和RNA合成期（G2/M期）細胞百分比之和。連續(xù)分割照射期間，流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示，實驗組在連續(xù)照射第1天S期細胞百分率最高（SPF=29.35%），細胞增殖指數(shù)同樣最高（PI=43.32%），后SPF及PI值均逐漸下降，第5天最低（SPF=15.47%，PI=25.32%），說明細胞增殖活性逐漸降低，增殖速度逐漸減慢；對照組第3天增殖活性最強（SPF=35.34%，PI=50.69%），第5天增殖速度最慢（SPF=19.35%，PI=30.67%）。這與MTT法所得結(jié)果一致，進一步驗證了其結(jié)果。

RNA干擾技術(shù)是通過將19nt-23nt的siRNA導(dǎo)入細胞，降解與其同源的mRNA，特異、高效地阻斷目的基因表達［10］。RNA干擾技術(shù)因其特異性和高效性，近年來已成為研究基因功能的重要工具。本實驗應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使CUL5基因沉默，導(dǎo)致其編碼的Cul5蛋白表達抑制，進而影響Cul5蛋白介導(dǎo)的一系列蛋白質(zhì)的降解，如p53蛋白和蛋白酪氨酸激酶。

野生型p53蛋白在DNA損傷后使細胞生長停滯于G1期，誘導(dǎo)細胞程序性死亡，抑制腫瘤細胞生長，維持遺傳穩(wěn)定性［11］。離子輻射、紫外輻射和DNA損傷劑等均可造成DNA損傷而導(dǎo)致p53蛋白活化，然后p53轉(zhuǎn)錄激活下游與腫瘤抑制有關(guān)的基因。石慧英等［12］研究發(fā)現(xiàn)高表達的P53蛋白可以使DNA損傷的CNE2細胞停滯于G1期，但仍然參與放射誘導(dǎo)的鼻咽癌細胞的損傷和凋亡過程。蛋白酪氨酸激酶在正常細胞的調(diào)節(jié)、通訊和發(fā)育等生物學(xué)方面起著十分重要的作用；其活性過高可導(dǎo)致下游信號途徑激活，從而導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化、增殖、對抗細胞凋亡、促進細胞存活。本實驗中CUL5基因表達抑制后CNE2細胞連續(xù)5 d分割照射后呈增殖狀態(tài)，推測可能是以上兩種途徑共同作用的結(jié)果。照射前2天實驗組細胞的增殖活性略高于對照組，可能是CUL5基因沉默后，Cul5蛋白表達減少，蛋白酪氨酸激酶因不能正常泛素化、降解，活性增高，激活其下游信號途徑，導(dǎo)致細胞增殖能力加強；中后期加速增殖現(xiàn)象改變，增殖速度減慢，則可能是由于照射劑量累加，引起細胞DNA雙鏈斷裂損傷，激活細胞內(nèi)因降解減少而高表達的P53蛋白，P53進而轉(zhuǎn)錄激活靶基因，阻滯細胞周期抑制G0/G1-S轉(zhuǎn)換、阻止DNA復(fù)制抑制細胞生長增殖并啟動細胞凋亡，其抑瘤作用與蛋白酪氨酸激酶作用相拮抗，并最終起主導(dǎo)作用。

需說明的是，本實驗雖證實CUL5基因表達情況與CNE2細胞照射中后期增殖活性有關(guān)，但是其機制尚不明確。我們推測的可能性是否存在，是否有其他未知因素在起作用，結(jié)果與活體實驗是否一致，確切的結(jié)論尚需更多的后續(xù)研究，如配合不同功能狀態(tài)的p53及進行動物實驗等來加以證實。

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