癲癇患者血漿神經(jīng)肽Y與免疫細(xì)胞的水平變化及其臨床意義

汪 純，戢翰升

癲癇是由于多種原因引起的大腦神經(jīng)元異常過度放電，造成腦功能暫時性的障礙。盡管目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有研究表明神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)都參與了癲癇的發(fā)生、發(fā)展[1，2]。目前對癲癇與三者關(guān)系的單方面研究較多，但將三者聯(lián)系起來去探討癲癇的發(fā)病機(jī)制的尚少，本文對癲癇患者不同時期外周血中免疫細(xì)胞和神經(jīng)肽（NPY）的水平進(jìn)行測定及比較，探討癲癇形成的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫機(jī)制及其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 檢測對象 2007-06～2009-06在筆者所在醫(yī)院神經(jīng)外科住院的36例顳葉癲癇患者，其中男18

例，女18例；年齡9～46歲，平均25.4歲；病程2～21

年，平均8.9年；近6個月發(fā)作頻率1～12次/月，平均5.9次/月。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：①具有典型的顳葉癲癇發(fā)作的臨床表現(xiàn)；②24 h視頻腦電圖顯示前或前中顳癲癇樣放電；③MRI顯示顳葉內(nèi)側(cè)病灶、海馬硬化。所有受檢對象均同時滿足以下條件：①入院前24 h內(nèi)無癲癇發(fā)作；②非腫瘤及占位引起的癲癇；③無傳染病或炎癥性疾??；④無急性嚴(yán)重的神經(jīng)疾?。X梗死，腦出血，腦炎等）；⑤2周內(nèi)未受過外傷及手術(shù)；⑥0.5年內(nèi)未用過激素和免疫抑制劑；⑦無肝腎功能不全；⑧無腎上腺皮質(zhì)或下丘腦垂體異常疾病；⑨無嚴(yán)重精神疾??；⑩非孕期及月經(jīng)期婦女。

1.2 試劑和儀器 單克隆抗體抗CD3FITC、抗CD4PE、抗CD8PE、抗 CD19PE及 CD16+56PE均由美國 Becton Dickinson 公司生產(chǎn)，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+分別代表總 T、Ts、TH、NK 細(xì)胞。紅細(xì)胞裂解液由BD公司生產(chǎn)。FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品，神經(jīng)肽Y放免試劑盒為深圳晶美公司產(chǎn)品，全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品，全自動血球計數(shù)儀為美國庫爾特公司產(chǎn)品。

1.3 檢測方法 所有患者均在入院時、入院10 min內(nèi)和24 h分別抽取靜脈血4 ml進(jìn)行檢測,一部分通過全自動血液分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)和分類；另一部分進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群和神經(jīng)肽Y檢測。外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測：樣品測定管中各加100 μl肝素抗凝血，加入上述單抗20 μl，振蕩混勻，室溫避光20 min，染色；加入1.5 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫避光放置10 min，破壞紅細(xì)胞；離心半徑8 cm，1 500 r/min離心5 min，棄上清；每管加入2 ml PBS，混勻，1000 r/min 離心 5 min，棄上清；加 PBS 1 ml，混勻，2 h內(nèi)檢測。以前向角散射光（FSC）為橫坐標(biāo)，側(cè)向角散射光（SSC）為縱坐標(biāo)，對淋巴細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門，吸獲10 000細(xì)胞用Cell Quest軟件進(jìn)行檢測分析。神經(jīng)肽Y測定：取2 ml靜脈血注入含10%EDTA二鈉30 μl和抑肽酶40 μl的試管中混勻，立即在4℃，3 000 r/min離心10 min分離血漿，置-40℃冰箱保存待檢。按試劑盒說明書進(jìn)行并計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件作數(shù)據(jù)處理，計量資料先求出均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，三組間比較采用單因素方差分析，NK細(xì)胞與神經(jīng)肽水平之間采用相關(guān)分析。

表 1 癲癇患者不同時間點免疫細(xì)胞及神經(jīng)肽Y水平（±s)

表 1 癲癇患者不同時間點免疫細(xì)胞及神經(jīng)肽Y水平（±s)

與對照組相比，*P<0.05，與入院10 min內(nèi)相比，▲P<0.05

細(xì)胞類型 入院時 入院10 min內(nèi) 入院24 h白細(xì)胞（109/L） 5.93±1.19 8.69±1.71* 6.48±0.60淋巴細(xì)胞（109/L） 2.12±0.62 2.85±1.07* 2.40±0.71中性粒細(xì)胞（109/L） 3.20±0.82 4.15±1.32* 3.49±0.88嗜堿粒細(xì)胞（109/L） 0.02±0.004 0.04±0.01 0.03±0.01嗜酸粒細(xì)胞（109/L） 0.21±0.06 0.20±0.07 0.19±0.05單核細(xì)胞（109/L） 17.23±6.38 14.21±6.82 17.51±4.62 B 細(xì)胞（109/L） 9.75±3.45 8.90±3.15 10.24±3.97 CD3+（%） 65.87±4.38 62.20±5.10* 66.32±4.70 CD4+（%） 43.38±5.32 37.26±6.28* 44.41±6.67 CD8+（%） 23.17±5.05 28.49±5.41* 22.87±5.26 CD4+/CD8+ 1.96±0.89 1.53±1.01* 2.07±0.94 NK（%） 12.38±5.28 21.29±6.21* 13.45±6.32 NPY（ng/L） 210.46±43.85 321.35±52.94* 243.68±48.62▲

2 結(jié)果

免疫細(xì)胞及神經(jīng)肽Y的測定結(jié)果見表1。癲癇患者入院10 min內(nèi)與入院時相比較外周血中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、CD8、NK細(xì)胞及神經(jīng)肽 Y 的水平均明顯升高 （P<0.05），CD3、CD4、CD4/CD8明顯降低 （P<0.05），其中CD4細(xì)胞降低13%；入院后24 h上述變化與入院時相比較無顯著性差異（P>0.05），血漿神經(jīng)肽Y與血漿NK細(xì)胞變化呈正相關(guān)（r=0.839，P<0.05）。

3 討論

自1977年Besedovsky提出 “免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”學(xué)說后，癲癇發(fā)病的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制得到國內(nèi)外學(xué)者廣泛重視并在探討癲癇發(fā)病機(jī)制方面進(jìn)行了深入的研究[2]。癲癇患者體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)存在密切而復(fù)雜的相互關(guān)系。三大系統(tǒng)之間通過雙向調(diào)節(jié)作用維持機(jī)體正常的生理活動，所以無論哪個系統(tǒng)出現(xiàn)問題都可以影響整個系統(tǒng)的平衡，促進(jìn)癲癇的發(fā)作。研究癲癇的神經(jīng)免疫機(jī)制對臨床治療有重要的指導(dǎo)意義。本研究系通過探討顳葉癲癇患者發(fā)作后不同時間外周血免疫細(xì)胞和神經(jīng)肽Y濃度的變化，從免疫調(diào)節(jié)分子水平和細(xì)胞免疫學(xué)水平上探討癲癇神經(jīng)免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。

有研究表明藥物也可引起免疫細(xì)胞的變化，筆者采用患者入院時為對照進(jìn)行研究，排除了藥物的影響，結(jié)果示入院后10 min內(nèi)外周血白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、CD8、NK細(xì)胞明顯升高。CD3、CD4、CD4/CD8 明顯降低（P<0.05），單核細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞無顯著性差異（P>0.05），提示炎癥反應(yīng)參與癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作可引起機(jī)體免疫細(xì)胞的改變，免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)處于失衡狀態(tài)。NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是早期抗感染的重要效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)癲癇病灶放電，擴(kuò)散，通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)造成神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能改變，使NK細(xì)胞和中性粒細(xì)胞迅速從細(xì)胞池中釋放到外周血中。目前認(rèn)為NK細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，它對淋巴細(xì)胞功能也有重要影響[3，4]。T淋巴細(xì)胞對機(jī)體所有體液免疫和細(xì)胞免疫類型均有重要的調(diào)節(jié)作用。CD3代表總T細(xì)胞水平，反映機(jī)體總的細(xì)胞免疫狀態(tài)；CD4協(xié)調(diào)B細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，CD3、CD4T淋巴細(xì)胞的減少必然導(dǎo)致免疫功能低下，CD4細(xì)胞的降低也證明在對炎癥的直接反應(yīng)中CD4細(xì)胞并不起主導(dǎo)作用[5]。CD8又分為T抑制細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞，其通過自身及抑制因子在免疫反應(yīng)中起負(fù)向作用，抑制CD4細(xì)胞和B細(xì)胞功能，從而抑制抗體形成及細(xì)胞免疫反應(yīng)。CD4/CD8比值保持動態(tài)平衡，以維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能的穩(wěn)定，比值降低說明機(jī)體T細(xì)胞亞群失衡，提示機(jī)體免疫功能低下。有文獻(xiàn)報道，CD3、CD4的含量和CD4/CD8比值降低可刺激B淋巴細(xì)胞分泌抗體形成免疫復(fù)合物、激活補(bǔ)體，使機(jī)體致病[6]。本文結(jié)果示入院24 h后外周血中免疫細(xì)胞與入院時無顯著性差異，說明這種免疫細(xì)胞的變化并不持久，癲癇發(fā)作時不僅抽搐本身對機(jī)體有損害，免疫系統(tǒng)的異常對機(jī)體也有潛在損傷，提示在癲癇發(fā)作時不僅要控制發(fā)作癥狀，也需對免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)預(yù)防再次發(fā)作；同時通過檢測外周血中24 h后免疫細(xì)胞的變化，可以排除因腫瘤、感染、腦膜炎、缺血性疾病等引起的癲癇。癲癇發(fā)作時的應(yīng)激狀態(tài)以及腦部潛在的結(jié)構(gòu)和功能異常均可引起免疫系統(tǒng)的異常，因此患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的變化只是機(jī)體癲癇發(fā)作時免疫狀態(tài)的一個側(cè)面反映。

NPY在腦中起著神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用，主要分布在大腦皮層、丘腦及腦干，尤以海馬濃度最高，而大腦邊緣系統(tǒng)海馬區(qū)與免疫系統(tǒng)關(guān)系最為密切，海馬神經(jīng)元異常電活動是許多類型癲癇的始動因素[7]，故NPY與癲癇的關(guān)系日益受到重視。本文結(jié)果表明癲癇發(fā)作后血漿中NPY顯著增加，這與國內(nèi)外研究結(jié)果一致[8，9]，但24 h后與入院時比較無顯著性差異。關(guān)于癲癇發(fā)作時NPY合成增加的機(jī)制目前尚不清楚，一般認(rèn)為有以下幾方面：①腦源性因素：Reibel等[10]認(rèn)為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是NPY合成增加原因之一，它對人類癲癇發(fā)病的病理生理作用是通過改變NPY的表達(dá)及其免疫反應(yīng)性而發(fā)揮作用的，此外興奮性谷氨酸神經(jīng)傳遞能調(diào)節(jié)NPY的表達(dá)，γ-氨基丁酸（GABA）A受體γ亞單位反義寡核苷酸也能引起NPY表達(dá)增高[11]；②外周因素：李亞軍等[12]發(fā)現(xiàn)在大鼠電驚厥前后血漿中NPY和NE含量成正相關(guān)，NPY與去甲腎上腺素（NE）共同處于交感神經(jīng)末梢，并常與NE一起釋放。癲癇發(fā)作時機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，去甲腎上腺素等釋放增多，故NPY釋放量增多并可能通過某種途徑釋放入血。此外在血小板中發(fā)現(xiàn)與NPY合成相關(guān)聯(lián)的信息RNA，表明血小板有合成NPY的能力。在病理狀態(tài)下，血小板被激活釋放NPY，可能作為血小板-血管間的一種傳遞，直接與其它血管活性物質(zhì)協(xié)同作用發(fā)揮生物效應(yīng)，引起癲癇發(fā)作后血中NPY含量增加。同時筆者發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞變化與NPY之間存在正相關(guān)性，隨著NPY濃度的增高免疫細(xì)胞也升高。癲癇發(fā)作引起中樞和外周神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的廣泛改變，通過海馬以及海馬以外部位使腦內(nèi)NPY濃度升高，引起下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸、交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)軸（SAM）功能亢進(jìn)。Wahleste等用NPY灌注清醒、自由活動鼠的室旁核和腦室，可使ACTH和糖皮質(zhì)激素（GC）分泌增加。GC是一種公認(rèn)的免疫抑制劑抑制淋巴細(xì)胞分裂增殖，引起免疫力低下；另外交感神經(jīng)興奮后其末梢釋放的兒茶酚胺類物質(zhì)，它通過與淋巴細(xì)胞膜表面上的受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的功能。可見癲癇發(fā)作時海馬-NPY-垂體-腎上腺軸對機(jī)體的免疫功能起著調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，癲癇患者存在免疫功能的低下，癲癇發(fā)作后血漿NPY含量明顯增加，NPY可能參與了免疫功能的調(diào)節(jié)。通過檢測不同時期外周血中免疫細(xì)胞和NPY的變化，可以排除因腫瘤、感染、腦膜炎、缺血性疾病等引起的癲癇，是一種簡單而重要的輔助診斷手段；同時在癲癇治療時應(yīng)輔以免疫調(diào)節(jié)治療。

[1]Herman JP,Ostrander MM,Mueller NK,et al.Limbic system mechanisms of stress regulation:hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis.Prog Neuropsychopharmacol[J].Biol Psychiatry,2005,29:1201-1213.

[2]朱長庚.神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)與癲癇發(fā)病機(jī)理的關(guān)系[J].解剖學(xué)報，2002，33(3):321.

[3]Harald H Hofstetter,Olaf Stuve,Hans-Peter Hartung.Temporary leukocyte effects in temporal lobe epilepsy?[J].Experimental Neurology,2008,(3):239-241.

[4]Jensen FE.Acute and chronic effects of seizures in the developing brain:Experimental models[J].Epilepsia,1999,40(suppl 1):s51-58.

[5]馮清泉.癲癇患者T淋巴細(xì)胞亞群、TNF-α和IL-6的測定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報，2004，39(4):663-664.

[6]金 波，鄭 幗，傅 雷.癲癇患者血清IL-2、IL-6、TNF-α含量和外周血B細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群水平[J].放射免疫學(xué)雜志，2006，19(6):474-475.

[7]鄭乃智，阮旭中.癲癇白細(xì)胞介素2研究進(jìn)展[J].腦與神經(jīng)疾病志，1997，5(2):128.

[8]Nagaki S,Fukamauchi F,Sakamoto Y,et al.Upregulation of brain somatostain and neuropeptides following lidocaine-induced kindling in the rat.Brain Res,2000,852(2):470-474.

[9]劉 丹，張秋燕.癲癇患兒神經(jīng)肽Y質(zhì)量濃度變化及臨床意義[J].中國實用兒科雜志，2004，20（11）：687-688.

[10]Reibel S,Vivien-Roels B,Le BT,et al.Overexpression of neuropeptide Y induced by brain-nurotrophic factor in the rat hippocampus is long lasting.Eur J Neurosci,2002,12(2):595-605.

[11]Mikkelsen JD,Karle J,Madsen TM,et al.Intrahippocampal infusion of antisense oligodeoxynucleotide to the GABA(A)receptor gamma 2 subunit enhances neuropeptide Y gene expression.Brain Res Bull,2001,54(1):91-99.

[12]李亞軍，謝 鵬.大鼠電休克后血漿神經(jīng)肽Y與去甲腎上腺素含量的變化[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，36(1):16-18.