阿托伐他汀對低氧大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖凋亡的影響

蔣凌志，張慶光，鐘 華

(廣州醫(yī)學(xué)院荔灣醫(yī)院ICU，廣東 廣州 510170)

阿托伐他汀是當(dāng)前最強效的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，廣泛用于降脂，能誘導(dǎo)兔髂動脈平滑肌細(xì)胞凋亡[1]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以減輕低氧大鼠肺動脈高壓、改善肺血管重塑[2]。由于肺動脈管壁主要由平滑肌構(gòu)成，本研究利用常壓低氧艙復(fù)制低氧肺動脈高壓大鼠模型，觀察阿托伐他汀對大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 低氧大鼠模型復(fù)制及實驗分組 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠40只，體重(180±20)g(廣東省動物實驗中心提供，合格證號2007A003)。隨機分為4組：對照組(Control，C)、低氧組(Hypoxia，H)、干預(yù)組Ⅰ、干預(yù)組Ⅱ，每組10只。干預(yù)組Ⅰ、Ⅱ組每天低氧前30 min分別灌胃給予阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司進(jìn)口分裝，批號85837007)1.5 mg/kg和3.0 mg/kg，對照組(C)和低氧組(H)給予生理鹽水0.5 ml。除對照組外，其他組置于常壓低氧箱內(nèi)，箱內(nèi)氧濃度穩(wěn)定于（10±0.5）%，每天低氧8 h，每周6 d，連續(xù)4周。

1.2 肺組織標(biāo)本的取材和制備 實驗結(jié)束時打開大鼠胸腔，取一側(cè)肺葉以10%甲醛緩沖液固定，梯度酒精順序脫水，二甲苯透明后石蠟包埋切片(厚5μm)，用于免疫組織化學(xué)分析和原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)研究。

1.3 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的免疫組織化學(xué)檢測 所有組織標(biāo)本均在同一條件下進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，一抗為小鼠抗大鼠PCNA抗體(武漢博士德，批號20080801)，二抗為羊抗小鼠免疫組化試劑盒(武漢博士德，批號200811)。PCNA陽性染色呈棕黃色細(xì)顆粒狀，主要位于細(xì)胞核。每只大鼠取一張切片，高倍鏡下觀察10條血管外徑約為100μm的肺小動脈，計數(shù)平滑肌細(xì)胞總數(shù)及PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目，計算PCNA陽性細(xì)胞所占百分比，即增殖指數(shù)(PI)。

1.4 TUNEL應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡細(xì)胞 操作按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Roche Diagnotics GmbH，14492200)說明書進(jìn)行，細(xì)胞核中有棕褐色顆粒者為陽性，即凋亡細(xì)胞。每只大鼠測量10條血管外徑約為100μm的肺小動脈，計算平滑肌細(xì)胞凋亡數(shù)目與細(xì)胞總數(shù)比值，即凋亡指數(shù)(AI)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩組間差異比較采用q檢驗，檢驗水準(zhǔn)為а=0.05。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖的影響 各組均可見增殖的PASMC細(xì)胞。低氧組PASMCs的PI較對照組顯著增高（P＜0.01）；干預(yù)組Ⅰ、ⅡPASMCs的PI與低氧組比較明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示阿托伐他汀對低氧大鼠PASMCs增殖有抑制作用，但兩干預(yù)組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 阿托伐他汀對大鼠PASMCs凋亡的影響 各組均可見凋亡的PASMCs細(xì)胞。低氧組大鼠PASMCs的AI與對照組比較顯著下降（P＜0.05）。干預(yù)組Ⅰ、Ⅱ大鼠PASMCs的AI與低氧組比較顯著增高（P＜0.05），提示阿托伐他汀對低氧大鼠PASMCs凋亡有促進(jìn)作用，但兩組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 阿托伐他汀對低氧大鼠肺動脈平滑肌增殖與凋亡的影響（±s）

表1 阿托伐他汀對低氧大鼠肺動脈平滑肌增殖與凋亡的影響（±s）

注：與對照組比較,*P＜0.01；與低氧組比較,△P＜0.05。

組別 例數(shù) 增殖指數(shù)PI(%)凋亡指數(shù)AI(%)對照組低氧組干預(yù)組Ⅰ干預(yù)組Ⅱ101010104.5±0.528.0±2.4*17.0±2.9△14.0±1.3△4.1±0.43.0±0.3*9.20±2.71△11.5±3.79△

3 討論

近年發(fā)現(xiàn)他汀類藥物對低氧肺動脈高壓有治療作用[3-5]，本課題前期研究也證實阿托伐他汀可以減輕低氧大鼠肺動脈高壓、改善肺血管重塑[2]。肺血管重塑的機制是細(xì)胞增殖與凋亡的平衡破壞，慢性缺氧時肺動脈壁細(xì)胞增殖加強而凋亡減少[6]。

實驗結(jié)果顯示各組大鼠肺組織切片中PASMCs細(xì)胞增殖和凋亡狀態(tài)并存。對照組增殖與凋亡基本平衡；低氧組大鼠PASMCs增殖顯著增加、凋亡顯著下降，因而出現(xiàn)顯著的肺血管重塑；與低氧組比較，兩干預(yù)組大鼠PASMCs增殖顯著降低、凋亡增加，但增殖仍超過凋亡，故肺血管仍有重塑現(xiàn)象，程度有所減輕。干預(yù)組PASMCs的AI與對照組比較有增加的趨勢，與文獻(xiàn)報道[7-8]一致。說明阿托伐他汀對低氧大鼠PASMCs存在雙重影響：既可以抑制其增殖，又可以促進(jìn)其凋亡，并通過這兩方面作用達(dá)到抑制肺血管重塑的效果。而兩干預(yù)組(1.5 mg/kg或3.0 mg/kg阿托伐他汀灌胃)之間比較，不論是PI還是AI均無明顯差異，提示阿托伐他汀抑制PASMCs增殖，促進(jìn)PASMCs凋亡的作用可能不存在劑量依賴。

有研究證實阿托伐他汀影響細(xì)胞增殖及凋亡與信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Stat3）通路密切相關(guān)，Stat3磷酸化活性調(diào)節(jié)其下游靶基因的表達(dá)[9]，因此，阿托伐他汀對Stat3下游靶基因Cyclin D1、Bcl-2的影響將在我們今后的實驗中進(jìn)一步深入研究。

[1]陳 斌,鄧玉蓮,吳志勇,等.阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化模型血管壁平滑肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2004,24(6):542-544.

[2]蔣凌志,張慶光,鐘 華.阿托伐他汀預(yù)防低氧性肺動脈高壓的實驗研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(24):4014-4136.

[3]Girgis RE,Li D,Zhan X,et al.Attenuation of chronic hypoxic pulmonary hypertension by simvastatin[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285:938-945

[4]潘殿柱,李永春.阿托伐他汀對低氧大鼠肺血管重建的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué),2005,14:1149-1151.

[5]張郁青,張秀偉,朱 穎,等.阿托伐他汀對慢性阻塞性肺疾病合并肺動脈高壓患者的影響[J].心肺血管病雜志,2009,28(4):250-253.

[6]陶清國,張珍祥,徐永健.慢性缺氧大鼠肺內(nèi)(肺血管壁)細(xì)胞增殖、凋亡及c-myc、P53基因表達(dá)研究[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,1999,15(2):169-172.

[7]Fouty BW,Rodman DM.Mevastatin can causes G1 arrest and induse apoptosis in pulmonary artery smooth muscle cells through a p27kip-independent pathway[J].Circ Res,2003,92(5):501-509.

[8]Nishimura T,VaszatL T,Faul JL.Simvastatin rescues rats from fatal pulmonary hypertension by inducing apoptosis ofneointimal smoothmusclecells[J].Circulation,2003,108(13):1640-1645.

[9]唐 梅,張 鉦,寧金民,等.JAKZ/STAT3信號通路在阿托伐他汀抗大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖凋亡中的作用研究[J].中國分子心臟病學(xué),2006,6(3):161-165.