不同齲敏感兒童變異鏈球菌臨床分離株合成胞外多糖能力的實(shí)驗(yàn)研究

楊江華，曹元書(shū)，劉興容

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

變異鏈球菌是乳牙齲患兒口腔中的主要致齲菌，合成胞外多糖的能力是其致齲的重要條件之一。變異鏈球菌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶（Glucosyl transferases，GTF）可利用蔗糖合成細(xì)胞外多糖，包括水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖。細(xì)胞外多糖對(duì)細(xì)菌在載體表面的附著以及細(xì)菌之間的集聚、維持生物膜的結(jié)構(gòu)、提供營(yíng)養(yǎng)等方面均起著十分重要的作用[1]。因此，研究細(xì)菌合成胞外多糖的能力對(duì)于細(xì)菌的致齲性研究有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)擬采用蒽酮法[2]比較不同齲敏感兒童變異鏈球菌臨床分離株合成水溶性及水不溶性葡聚糖的能力，為進(jìn)一步研究?jī)和x病的發(fā)病特點(diǎn)和預(yù)防措施奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 主要的儀器和設(shè)備 厭氧培養(yǎng)箱YQX型(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1100型（北京瑞利分析儀器公司）；定時(shí)磁力攪拌器JB-90-1型(上海天平儀器廠)；低頻離心機(jī)TDL-40B型（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及細(xì)菌培養(yǎng) 變異鏈球菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株（S.mutans）ATCC 25175（血清型C）由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院教育部口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。變異鏈球菌臨床分離株前期實(shí)驗(yàn)分離得到的不同齲敏感兒童口腔變異鏈球菌111株，其中高齲組44株，中齲組36株，無(wú)齲組31株[高齲者：齲失補(bǔ)指數(shù)(dmft)≥6，中齲者：6＞dmft≥4，無(wú)齲者：dmft＝0]。變異鏈球菌臨床分離株和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株常規(guī)復(fù)蘇，經(jīng)鑒定為純培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種于腦心浸液肉湯(BHI)液體培養(yǎng)基，厭氧（80%N2、10%H2、10%CO2）培養(yǎng)24 h，鏡檢無(wú)污染后，3000 r/min，離心15 min，棄上清，收集細(xì)菌，無(wú)菌生理鹽水洗菌兩次，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整為于紫外分光光度計(jì)540 nm處吸光度A=1.0的菌懸液，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備 取各變異鏈球菌臨床分離株菌懸液，按菌液與含1%蔗糖的BHI液體培養(yǎng)基1:10（v/v）比例接種細(xì)菌，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，3000 r/min，離心20 min，收集上清液，細(xì)菌沉淀物用5 ml蒸餾水洗滌、離心兩次，三次上清液合并；水洗后的細(xì)菌加入0.5 mol/L NaOH 5 ml洗滌、離心三次，合并上清液。兩部分上清液各取適量，分別加入三倍體積無(wú)水乙醇，4℃冰箱放置過(guò)夜，離心，棄水相，沉淀分別加入5 ml蒸餾水及5 ml 0.1 mol/L NaOH溶液溶解，備用。

1.3.2 蒽酮試劑和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液的制備 蒽酮試劑的配制：取200 mg蒽酮（Anthrone，上海生工生物有限公司）溶解于100 ml的濃硫酸中，攪拌溶解，放入4℃冰箱保存。葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液的配制：稱取1.0 g分子量為9000 Da的葡聚糖（北京天佑達(dá)生物工程有限公司）溶于100 ml蒸溜水中做儲(chǔ)存液，使用時(shí)取1.0 ml稀釋至100 ml，保存于4℃冰箱中。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取葡聚糖稀釋液0.00 ml、0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml，加入蒸餾水至1.00 ml，在 15℃水浴中加入蒽酮試劑3.00 ml，攪拌3 min后放入95℃水浴中煮6 min，冷卻，分別在分光光度計(jì)625 nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品的測(cè)定 取樣品1.0 ml，加蒽酮試劑3 ml，95℃水浴6 min，冷卻，紫外光分光光度計(jì)測(cè)定625 nm處的吸光度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANVOA分別對(duì)不同細(xì)菌合成水溶性葡聚糖和水不溶性葡聚糖能力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(α=0.05)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的估計(jì) 用葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和蒽酮法測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行葡聚糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程估計(jì)?；貧w公式：y(葡聚糖量)＝A+Bx，系數(shù)A＝-0.00136，回歸系數(shù)B＝0.07306，判定相關(guān)系數(shù) R2＝0.999。y＝0.07306x－0.00136，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 合成胞外多糖的測(cè)定 不同齲敏感兒童變異鏈球菌菌株合成胞外多糖的結(jié)果如表1。

表1數(shù)據(jù)顯示，不同菌株之間無(wú)論是合成水溶性葡聚糖還是水不溶性葡聚糖能力差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)高、中齲組細(xì)菌合成細(xì)胞外多糖的量和標(biāo)準(zhǔn)株合成細(xì)胞外多糖的量無(wú)明顯不同，但是與無(wú)齲組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同齲敏感兒童變異鏈球菌合成胞外多糖的比較(±s，mg/L)

表1 不同齲敏感兒童變異鏈球菌合成胞外多糖的比較(±s，mg/L)

注：*F=4.504，P＜0.05，**F=6.958，P＜0.05。

組別水不溶性葡聚糖*水溶性葡聚糖*高齲組中齲組無(wú)齲組標(biāo)準(zhǔn)株0.029±0.0150.024±0.0120.016±0.0110.032±0.0020.102±0.0430.095±0.0470.065±0.0440.132±0.001

在高齲組發(fā)現(xiàn)有部分菌株無(wú)論是合成水溶性葡聚糖還是水不溶性葡聚糖的量均高于其他菌株，如16-1、20-3、18-2、11-1號(hào)菌株。來(lái)自中齲組的15-2、1-1號(hào)菌株合成胞外多糖的能力也高于其他菌株；有部分菌株合成水溶性葡聚糖的量明顯高于其他菌株，如高齲組和中齲組中間的2-3、16-3、20-1、12-1號(hào)菌株。但是來(lái)自無(wú)齲組的菌株6-3號(hào)合成水溶性葡聚糖的量也很高。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)無(wú)論是高、中齲組變異鏈球菌還是無(wú)齲組變異鏈球菌合成水溶性葡聚糖的量均多于水不溶性葡聚糖的量。

3 討論

變異鏈球菌是牙菌斑生物膜中的優(yōu)勢(shì)菌，與齲病的發(fā)生有密切關(guān)系[3]。它能利用蔗糖合成胞外多糖，促使牙菌斑生物膜的形成和穩(wěn)定的維持。因此細(xì)胞外多糖的產(chǎn)量是變異鏈球菌致齲能力的一個(gè)衡量指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)高齲和中齲組兒童變異鏈球菌臨床分離株在體外合成的水溶性和水不溶性葡聚糖量均顯著高于無(wú)齲組變異鏈球菌。而且研究還發(fā)現(xiàn)有部分菌株合成的水溶性和水不溶性葡聚糖量都明顯高于其他菌株，這些菌株大多來(lái)自高齲組，中齲組也有少量的幾株，這提示有變異鏈球菌高致齲毒力株存在的可能，而且高毒力株主要存在于高齲組中，這與前期產(chǎn)酸耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[4]；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)有一株來(lái)自無(wú)齲組，可能是無(wú)齲組菌株發(fā)生了基因突變。國(guó)內(nèi)黃曉晶等[5]對(duì)恒牙齲的研究顯示高齲組個(gè)體定植的合成水不溶性及水溶性葡聚糖能力強(qiáng)的菌株所占比例顯著高于無(wú)齲組，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。Alaluusua等[6]的研究發(fā)現(xiàn)齲活躍幼兒與無(wú)齲幼兒口腔中不同基因型變異鏈球菌合成細(xì)胞外多糖的能力不同，但細(xì)胞外多糖合成能力不同的菌株在兩組的分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mattos-Graner等[7]的研究結(jié)果則顯示變異鏈球菌水不溶性葡聚糖合成與乳牙齲發(fā)病率呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)無(wú)論是高、中齲組變異鏈球菌還是無(wú)齲組變異鏈球菌合成的水溶性葡聚糖均多于水不溶性葡聚糖，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者研究結(jié)果一致。程茜等[8]通過(guò)酚硫酸法研究變異鏈球菌胞外多糖合成的能力，結(jié)果表明變異鏈球菌水溶性葡聚糖合成能力強(qiáng)于水不溶性葡聚糖。劉琪等[9]用Seff蒽酮定糖法對(duì)變異鏈球菌Ⅰ型Mutans和Ⅲ型Sobrious合成葡聚糖進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌Ⅰ型Mutans合成水溶性葡聚糖的能力高于水不溶性葡聚糖。

迄今已證實(shí)變異鏈球菌具有3種葡萄糖耐量因子(GTF)，分別合成水溶性及水不溶性葡聚糖。并且，不同血清型變異鏈球菌產(chǎn)生的GTF在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上都存在差異。各種血清型中，C型合成的水溶性葡聚糖較多，D型合成的水不溶性葡聚糖較多[10]。變異鏈球菌還可以按遺傳性分為Ⅰ-Ⅵ型，而在人類口腔中血清型C的遺傳Ⅰ型變異鏈球菌最多，檢出率高達(dá)80%[11]。這可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)不同齲敏感兒童口腔變鏈菌臨床分離株合成水溶性葡聚糖含量多于水不溶性葡聚糖的原因。

有研究表明，GTF及其合成的水不溶性葡聚糖在變鏈粘附中起重要作用。而Ⅰ型變異鏈球菌的粘附主要由變異鏈球菌表面的粘附素和唾液的受體介導(dǎo)完成，不依賴GTF及其合成的水不溶性葡聚糖。由此可以推測(cè)，在變異鏈球菌在牙面的粘附作用中，可能主要依賴唾液的介導(dǎo)，較少依賴于葡聚糖。對(duì)于不同基因型致齲能力不同的原因，變異鏈球菌致齲高毒力株在齲病發(fā)生過(guò)程中的具體作用機(jī)制以及合成水溶性和水不溶性葡聚糖的差異是否對(duì)變異鏈球菌的粘附產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步的研究。

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