非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR和KRAS狀態(tài)比較的meta分析

韓琤波 鄒華偉 馬潔韜 周洋 趙健竹

作者單位：110022 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腫瘤科（通訊作者：韓琤波，E-mail: hancb@126.com）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡首要死因。大約70%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者在初始診斷時(shí)即為局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病[1]。NSCLC具有多基因改變積聚的特點(diǎn)[2,3]，較為常見的基因突變包括p53、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和KRAS等[4]。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI），如吉非替尼和厄洛替尼，作用于EGFR胞內(nèi)段酪氨酸激酶區(qū)ATP結(jié)合域。當(dāng)癌細(xì)胞發(fā)生EGFR外顯子18、19和21突變激活時(shí)，可顯著提高局部晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的客觀緩解率，延長總生存期[5]。國外研究[6-8]顯示，KRAS突變見于多達(dá)30%的肺腺癌，是NSCLC的預(yù)后不良因素以及EGFR-TKI療效不佳的預(yù)測指標(biāo)。若干研究[9-11]顯示，EGFR基因擴(kuò)增、mRNA和蛋白表達(dá)水平也可用來預(yù)測TKI治療反應(yīng)。60%-80%的NSCLC存在EGFR表達(dá)，而其一度也被認(rèn)為是EGFR單克隆抗體（如西妥昔單抗）的療效預(yù)測指標(biāo)。西妥昔單抗作用于EGFR胞外域，臨床試驗(yàn)顯示西妥昔單抗聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療顯著改善晚期NSCLC患者的總生存[12]。值得關(guān)注的是，不表達(dá)EGFR和部分EGFR野生型的NSCLC患者也可能從EGFR-TKI或EGFR單克隆抗體治療中獲益[13]。有研究者[14]提出可能是由于EGFR突變或表達(dá)狀態(tài)的確定往往是通過原發(fā)灶手術(shù)切除或活檢獲得組織進(jìn)行分析，而大量的分子改變可能發(fā)生在轉(zhuǎn)移過程中。即原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間可能存在不同的EGFR和KRAS基因狀態(tài)。因此，我們通過對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行meta分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)比較配對(duì)的原發(fā)肺癌灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR和KRAS基因狀態(tài)以指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1 材料和方法

1.1 文獻(xiàn)資料來源 通過Pubmed數(shù)據(jù)庫檢索所有符合以下檢索詞的文獻(xiàn)。串聯(lián)檢索關(guān)鍵詞：primary NSCLC和metastases，加入并列檢索詞：EGFR或KRAS。中文檢索通過中國期刊全文數(shù)據(jù)庫，檢索關(guān)鍵詞：肺癌、EGFR或KRAS。末次檢索日期為2010年5月10日。

1.2 文獻(xiàn)資料的納入標(biāo)準(zhǔn) 未曾接受過EGFR-TKI治療且具有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或其它肺外轉(zhuǎn)移灶的NSCLC患者。研究對(duì)象必須包含配對(duì)的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織獲取方法不限，可以為支氣管鏡、穿刺或手術(shù)后組織。檢測指標(biāo)具備以下任何之一者納入本研究：①EGFR突變檢測位點(diǎn)至少包括外顯子19和21；②KRAS突變位點(diǎn)至少包括密碼子12和13；③EGFR蛋白表達(dá)采用統(tǒng)一可評(píng)價(jià)的免疫組織化學(xué)（IHC）方法和標(biāo)準(zhǔn)；④EGFR基因拷貝數(shù)（gene copy number）采用統(tǒng)一的熒光原位雜交（FISH）方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 文獻(xiàn)資料的排除標(biāo)準(zhǔn) 具有以下之一者排除該項(xiàng)研究或該病例研究：①曾接受過EGFR-TKI治療的NSCLC；②無配對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，或原發(fā)灶配對(duì)外周血標(biāo)本；③無明確病理診斷；④肺轉(zhuǎn)移癌。具有以下之一者排除該指標(biāo)研究：①文獻(xiàn)資料中未明確EGFR或KRAS的突變特征，或不符合觀察的最少檢測位點(diǎn)；②EGFR蛋白表達(dá)、基因擴(kuò)增無統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 meta分析指標(biāo)及相關(guān)定義 meta分析比對(duì)NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR、KRAS狀態(tài)，包括：①EGFR基因突變；②EGFR基因拷貝數(shù)；③EGFR蛋白表達(dá)；④KRAS基因突變。

所有納入的研究采用統(tǒng)一的可評(píng)價(jià)方法。①EGFR FISH陽性定義：具有高水平的多倍體（40%以上細(xì)胞中≥4個(gè)拷貝數(shù)）或是基因擴(kuò)增?；驍U(kuò)增定義為出現(xiàn)緊密基因簇（tight gene clusters），每個(gè)細(xì)胞中基因/染色體之比≥2，或是在≥10%分析細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞≥15個(gè)基因拷貝[15]。②EGFR蛋白IHC陽性定義：10%以上腫瘤細(xì)胞膜染色定義為陽性[16]。③EGFR和KRAS突變采用直接測序法。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行各研究間的異質(zhì)性檢驗(yàn)，假設(shè)齊性檢驗(yàn)的α值為0.1。若異質(zhì)性檢驗(yàn)提示各研究結(jié)果間異質(zhì)性不顯著（P＞0.10），則采用Mantel Haenszel固定效應(yīng)模型計(jì)算合并的相對(duì)危險(xiǎn)度（relative rate, RR）值及其95%可信區(qū)間（confidence interval, CI）；反之，若同質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果提示各研究異質(zhì)性顯著（P≤0.10），則采用Dersimonian-Laird隨機(jī)效應(yīng)模型（D-L法）計(jì)算合并后的RR值及其95%CI。應(yīng)用meta分析軟件包RevMan 4.2實(shí)現(xiàn)上述計(jì)算，以納入meta分析的各研究的1/SE代替樣本量作為縱坐標(biāo)，以各研究的OR值作為橫坐標(biāo)繪制漏斗圖，直觀上評(píng)估發(fā)表偏倚的影響。另外以失安全系數(shù)（fail-safe number, Nfs）來估計(jì)發(fā)表偏倚對(duì)在P=0.05水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的合并檢驗(yàn)結(jié)果的影響。Nfs0.05=（ΣZ/1.64）2-K，此值越大說明發(fā)表偏倚的影響越小，結(jié)論的可靠性越好。

表 1 納入的NSCLC EGFR突變研究Tab 1 Eligible studies for EGFR mutation of NSCLC

圖 1 原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR基因突變meta分析森林圖Fig 1 Forest graph of EGFR mutation meta-analysis between primary NSCLC and metastases

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)基本情況 中國期刊全文數(shù)據(jù)庫未檢出相關(guān)文獻(xiàn)，通過Pubmed共檢索到31篇相關(guān)文獻(xiàn)，經(jīng)過篩選納入meta分析共14篇，具有配對(duì)的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶病例共598例 vs 598例。14篇所對(duì)比的EGFR基因突變、擴(kuò)增、EGFR蛋白表達(dá)和KRAS基因突變均歸一為統(tǒng)一的方法評(píng)價(jià)。其中EGFR突變相關(guān)7篇，配對(duì)357例；KRAS突變相關(guān)6篇，配對(duì)193例；EGFR蛋白表達(dá)相關(guān)6篇，配對(duì)195例；EGFR擴(kuò)增相關(guān)4篇，配對(duì)133例。納入研究的具體數(shù)據(jù)參見表1-表4。

2.2 NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR和KRAS基因狀態(tài) 同質(zhì)性檢驗(yàn)顯示各指標(biāo)研究組間P＞0.10，選擇固定效應(yīng)模型計(jì)算合并的RR值及其95%CI。原發(fā)灶中EGFR蛋白表達(dá)高于轉(zhuǎn)移灶，71.02% vs 61.93%，RR=1.13（95%CI: 0.98-1.31,P=0.09）；轉(zhuǎn)移灶中EGFR的基因拷貝數(shù)高于原發(fā)灶，38.97% vs 28.67%，RR=0.74（95%CI: 0.53-1.02, P=0.06）。而KRAS基因的突變頻率在原發(fā)灶中高于其轉(zhuǎn)移灶，25.91% vs 18.65%，RR=1.39（95%CI: 0.95-2.03, P=0.09）。EGFR基因在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的突變頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，17.17% vs 19.89%，RR=0.86（95%CI: 0.65-1.15,P=0.31），參見圖1-圖4。漏斗圖直觀顯示EGFR和KRAS基因突變呈倒漏斗圖形，且對(duì)稱性良好；而EGFR基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)研究對(duì)稱性較差，Nfs分別為9.44、10.48。漏斗圖參見圖5。

2.3 NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR和KRAS基因符合情況 EGFR和KRAS基因狀態(tài)在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的不一致率分別為：EGFR基因突變，17.09%（0-57.89%）；EGFR擴(kuò)增，27.07%（22.86%-32.14%）；EGFR蛋白表達(dá)，27.84%（10.64%-54.55%）；KRAS基因突變，25.91%（22.50%-36.36%）。森林圖（圖6）顯示，EGFR和KRAS基因狀態(tài)或蛋白表達(dá)情況在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中一致的較不一致的明顯占優(yōu)（P＜0.01）。

表 2 納入的NSCLC EGFR擴(kuò)增研究Tab 2 Eligible studies for EGFR amplification of NSCLC

圖 2 原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR基因擴(kuò)增meta分析森林圖Fig 2 Forest graph of EGFR amplification meta-analysis between primary NSCLC and metastases

3 討論

EGFR激活突變與75%-95%的EGFR-TKI治療的客觀有效率相關(guān)，而KRAS突變與EGFR-TKI敏感性缺乏相關(guān)[6-8]。也有研究[9-11]發(fā)現(xiàn)EGFR基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)可以作為吉非替尼臨床獲益的預(yù)測標(biāo)志。研究[23]顯示，肺癌在分子水平上即便在同一腫瘤中也常常表現(xiàn)出異質(zhì)性，且在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中，EGFR突變、表達(dá)以及基因拷貝數(shù)往往也是不穩(wěn)定的，即轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)腫瘤的基因狀態(tài)往往不一致。而我們通過7項(xiàng)配對(duì)研究的meta分析顯示，NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR突變率基本一致，RR=0.86（P=0.31），突變狀態(tài)符合率達(dá)82.9%，森林圖顯示EGFR基因狀態(tài)一致的NSCLC明顯占優(yōu)（P=0.003）。結(jié)果提示EGFR突變狀態(tài)在原發(fā)灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶中應(yīng)是比較保守的。

通過對(duì)KRAS基因突變的meta分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)灶KRAS基因的突變率明顯高于轉(zhuǎn)移灶（OR=1.39, 95%CI：0.95-2.03, P=0.09）。原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶KRAS基因狀態(tài)一致率為74.9%，KRAS基因狀態(tài)一致的NSCLC仍然占優(yōu)勢。盡管KRAS突變似乎與NSCLC早期發(fā)生相關(guān)，但不能排除KRAS突變?cè)谀[瘤進(jìn)展過程中消失[29]。這或許可以解釋KRAS基因突變?cè)谠l(fā)灶和異時(shí)性轉(zhuǎn)移灶中不一致的原因。我們的數(shù)據(jù)表明，KRAS基因狀態(tài)在轉(zhuǎn)移過程中不總是保持穩(wěn)定。一些NSCLC癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中丟失了KRAS突變基因型。盡管從原發(fā)腫瘤KRAS野生型到轉(zhuǎn)移灶中突變型的轉(zhuǎn)變，或是相反的情形都被觀察到，但總體上原發(fā)灶KRAS基因突變頻率明顯高于轉(zhuǎn)移灶。除部分NSCLC癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中丟失了KRAS突變基因型這一解釋之外，也可能是KRAS野生型癌細(xì)胞早期更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，而此時(shí)KRAS突變型克隆株癌細(xì)胞尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。當(dāng)然某些特定的基因型或許具有特定的器官轉(zhuǎn)移親嗜性，本研究納入的轉(zhuǎn)移灶部位不同，而不同轉(zhuǎn)移部位癌細(xì)胞的異質(zhì)性也有報(bào)道[30,31]，尚需對(duì)此進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。另一原因可能是受限于檢測方法的敏感性和特異性，這涉及到異質(zhì)性腫瘤內(nèi)發(fā)生低頻率的EGFR基因突變的檢出率，目前尚缺乏EGFR和KRAS突變最佳的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)。直接測序法檢測突變DNA的閾值通常在20%至25%以上（以野生型DNA為背景）[19]。通過測序確定的突變可以被視為病灶占優(yōu)勢的突變狀態(tài)。結(jié)合突變富集PCR（mutant-enriched PCR, ME-PCR）和異源雙鏈法分析法（heteroduplex analysis, HA）可以增加EGFR和KRAS突變檢出的敏感性。Cortot等[18]研究顯示，當(dāng)應(yīng)用ME-PCR這一更敏感的方法時(shí)，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中KRAS突變狀態(tài)的不一致被排除3例。盡管如此，其不一致率仍達(dá)到14%（3/21）。Park等[21]利用異源雙鏈分析法分析原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的EGFR突變情況，檢出率分別增加8例和15例，不一致率仍達(dá)15.8%（16/101）。顯然EGFR和KRAS突變?cè)谠l(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的不一致性不能完全歸于EGFR突變檢測技術(shù)方法的局限性，即使KRAS突變只在一小部分細(xì)胞中檢測出，也可能賦予他們抗酪氨酸激酶抑制劑特性。而同一患者中的不同區(qū)域和位置的腫瘤病灶對(duì)靶向治療的反應(yīng)也可能存在差異，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

表 3 納入的NSCLC EGFR蛋白表達(dá)研究Tab 3 Eligible studies for EGFR protein expression of NSCLC

圖 3 NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR蛋白表達(dá)meta分析森林圖Fig 3 Forest graph of EGFR protein expression meta-analysis between primary NSCLC and metastases

表 4 納入的非小細(xì)胞肺癌KRAS突變研究Tab 4 Eligible studies for KRAS mutation of NSCLC

圖 4 NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶KRAS基因突變meta分析森林圖Fig 4 Forest graph of KRAS mutation meta-analysis between primary NSCLC and metastases

圖 5 納入的NSCLC原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR或KRAS狀態(tài)研究漏斗圖。A：EGFR突變；B：EGFR擴(kuò)增；C：EGFR蛋白表達(dá)；D：KRAS突變。Fig 5 Funnel plot of eligible studies for EGFR or KRAS status in NSCLC. A: EGFR mutation; B: EGFR amplification; C: EGFR protein expression; D:KRAS mutation.

圖 6 非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR或KRAS狀態(tài)符合情況meta分析森林圖。A：EGFR突變；B：EGFR擴(kuò)增；C：EGFR蛋白表達(dá)；D：KRAS突變。Fig 6 Forest graph of coincident status meta-analysis of EGFR or KRAS between primary NSCLC and metastases. A: EGFR mutation; B: EGFR amplification; C: EGFR protein expression; D: KRAS mutation.

腫瘤異質(zhì)性的研究[32,33]顯示，不同人類腫瘤的癌細(xì)胞群中存在廣泛的細(xì)胞遺傳學(xué)和表觀遺傳變異。激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection, LCM）技術(shù)也被用來捕獲混合組織標(biāo)本中的純瘤細(xì)胞以得到更精確的EGFR和KRAS突變分析結(jié)果。Reymond等[34]比較骨髓微轉(zhuǎn)移和原發(fā)瘤KRAS突變時(shí)發(fā)現(xiàn)，播散的癌細(xì)胞不總是克隆于原發(fā)瘤灶。此外，循環(huán)血癌細(xì)胞和原發(fā)瘤在基因和蛋白表達(dá)上也存在相當(dāng)大的異質(zhì)性[35,36]。本研究針對(duì)EGFR基因拷貝數(shù)和EGFR蛋白表達(dá)meta分析結(jié)果顯示，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR基因拷貝數(shù)和蛋白表達(dá)均存在較大差別，EGFR基因高拷貝數(shù)似乎更多見于轉(zhuǎn)移灶中（RR=0.74, 95%CI: 0.53-1.02, P=0.06）。而原發(fā)灶中EGFR蛋白表達(dá)率多于轉(zhuǎn)移灶（RR=1.13, 95%CI:0.98-1.31, P=0.09）。原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR蛋白表達(dá)和基因拷貝數(shù)一致率分別為70.8%和72.9%。其中，Watzka等[28]通過尸檢獲得NSCLC原發(fā)灶和相應(yīng)轉(zhuǎn)移灶用以評(píng)價(jià)EGFR蛋白表達(dá)情況，尸檢取材的優(yōu)點(diǎn)是腫瘤組織足夠分析，避免了活檢組織取材不足所致假陰性。結(jié)果表明，即便如此原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤之間EGFR表達(dá)的不一致率仍達(dá)30%。臨床研究[37,38]顯示，EGFR高拷貝數(shù)和EGFR突變相關(guān)，NSCLC中，EGFR突變較EGFR蛋白表達(dá)為一個(gè)更好的EGFR靶向治療獲益的預(yù)測指標(biāo)[39]。研究還發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中EGFR基因的高拷貝數(shù)和基因突變激活并不總是伴隨著EGFR蛋白陽性表達(dá)。meta分析數(shù)據(jù)顯示，至少從間接的分布情況來看，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶EGFR突變、EGFR基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)三者之間似乎并無相關(guān)性。但受直接研究三者之間相關(guān)性的研究數(shù)量所限，本文并未做進(jìn)一步分析評(píng)價(jià)。FLEX試驗(yàn)更新結(jié)果顯示，EGFR和KRAS狀態(tài)似乎均不是西妥昔單抗聯(lián)合化療臨床獲益的預(yù)測指標(biāo)。盡管有研究[9-11]顯示，EGFR基因擴(kuò)增和蛋白表達(dá)水平也可以用來預(yù)測TKI治療反應(yīng)，但目前仍缺乏二者作為EGFR-TKI和EGFR單克隆抗體療效預(yù)測指標(biāo)的有力證據(jù)。

漏斗圖直觀顯示部分指標(biāo)略有不對(duì)稱，考慮各項(xiàng)指標(biāo)檢測在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中狀態(tài)不存在研究者和編輯喜好的“陽性”傾向性，結(jié)合失安全系數(shù)結(jié)果入選文獻(xiàn)的發(fā)表偏倚不大。倒漏斗圖不對(duì)稱原因考慮為研究樣本較少異質(zhì)性明顯所致，需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究。

總之，針對(duì)目前有限的配對(duì)研究所做的系統(tǒng)評(píng)價(jià)結(jié)合當(dāng)前研究，EGFR突變?cè)贜SCLC轉(zhuǎn)移過程中似乎是以一種穩(wěn)定的方式維持，而肺癌細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性或許是導(dǎo)致EGFR基因狀態(tài)部分不一致的原因。KRAS突變基因型早期即可出現(xiàn)，而在轉(zhuǎn)移后有所減低，因而原發(fā)灶中KRAS基因突變更能反映出肺癌周身癌灶信息。聯(lián)合檢測原發(fā)灶中EGFR和KRAS基因突變可作為肺癌靶向治療的療效預(yù)測指標(biāo)，單獨(dú)對(duì)轉(zhuǎn)移灶做KRAS狀態(tài)分析可能會(huì)引入更多抵抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑治療的患者。鑒于EGFR基因高拷貝數(shù)在轉(zhuǎn)移灶中所占的優(yōu)勢，或許在治療選擇時(shí)有必要對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行EGFR擴(kuò)增分析以選擇可能更適宜的NSCLC治療患者，但具體臨床選擇仍需慎重。EGFR蛋白表達(dá)檢測作為EGFR-TKI療效預(yù)測指標(biāo)目前仍缺乏足夠的臨床試驗(yàn)證據(jù)，其價(jià)值有待于進(jìn)一步評(píng)估。若原發(fā)腫瘤顯示EGFR高表達(dá)，針對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)一步活檢似乎沒有必要，故不推薦對(duì)轉(zhuǎn)移灶常規(guī)做EGFR蛋白表達(dá)的檢測。

盡管如此，但鑒于總體研究樣本量有限，仍然不能確定原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中存在的分子異質(zhì)性到底是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散過程中遺傳不穩(wěn)定的結(jié)果還是腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的結(jié)果。因此，仍需在擴(kuò)大樣本的前提下，采用更佳的檢測方法來確定EGFR和KRAS基因狀態(tài)在原發(fā)NSCLC和不同區(qū)域和部位轉(zhuǎn)移灶的異質(zhì)性，并觀測TKI等靶向治療藥物的臨床反應(yīng)性，這對(duì)于EGFR靶向治療策略選擇具有重要意義。

致謝：感謝中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床流行病教研室周波對(duì)本研究提供的傾力支持。