高效液相色譜法檢測兔血漿中甲氧滴滴涕的濃度

周紅宇，肖仲祥，張馨，王萍，胡國新

（溫州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

甲氧滴滴涕（methoxychlor，MXC），又稱甲氧氯，化學(xué)名為1，1-三氯-2，2-雙（4-甲氧基苯基）乙烷，屬有機(jī)氯殺蟲劑，因具有高效和低殘留的特點(diǎn)而取代滴滴涕（DDT）廣泛應(yīng)用，在土壤、工業(yè)廢水及城市污水中均有檢出[1-2]。近年來的研究表明MXC能干擾生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，降低生育能力，并且具有遺傳毒性，是重要的農(nóng)藥類內(nèi)環(huán)境干擾物[3-6]。MXC為脂溶性物質(zhì)，在受污染的環(huán)境中的可通過胃腸道、皮膚及呼吸道進(jìn)入機(jī)體，但其在體內(nèi)的毒動(dòng)學(xué)過程尚缺乏研究。本研究采用高效液相色譜（HPLC）法檢測血漿樣品中的MXC濃度，并研究其在兔體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué)過程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：高效液相色譜儀為美國Agilent1100系列，包括G1322A在線脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315B二極管陣列檢測器，Agilent化學(xué)工作站（Rev A.08.03.[847]）。電子分析天平，渦旋混合器，恒溫水浴箱，臺式高速離心機(jī)等。

1.1.2 藥品與試劑：MXC（批號357-25，純度98%，北京明尼克分析儀器設(shè)備中心）；馬拉硫磷（批號5041-2168，純度99.2%，安捷倫科技有限公司）；乙腈（一級色譜純，德國默克公司）；乙酸乙酯，正己烷（色譜純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；甲醇（一級色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；NaF（批號20051125，純度98%，上海三愛試劑有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：日本大耳兔5只，體重（3.0±0.22）kg，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：浙醫(yī)動(dòng)字第2203001號。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5μm，Agilent，USA），流動(dòng)相為乙腈-水（70:30，V/V）。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：240 nm；參比波長：380 nm；檢測靈敏度：0.05 mAU；內(nèi)標(biāo)：馬拉硫磷。

1.2.2 血漿樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確吸取血漿1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入25 g·L-1NaF 100μL，靜置10min加入0.3 g·L-1馬拉硫磷內(nèi)標(biāo)液40μL，加乙酸乙酯-正己烷（4:1，V/V）萃取液2 mL，渦旋混勻后3000×g 離心10 min，取上層有機(jī)相1.8 mL于另一錐底試管中，37℃水浴條件下氮?dú)饬鞔蹈?。?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，20μL進(jìn)樣檢測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取9只10 mL具塞試管，加入空白血漿1.0 mL，25 g·L-1NaF 100μL，靜置10 min后，加入不同濃度的MXC標(biāo)準(zhǔn)液，配成濃度相當(dāng)于0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10 μg·mL-1的血漿樣品，按“1.2.2”項(xiàng)”方法處理后，測定MXC峰面積Ai和內(nèi)標(biāo)峰面積As，以Ai/As為縱坐標(biāo)，以所對應(yīng)各點(diǎn)濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

MXC的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：C=1.1573Ai/As-0.0245 (r=0.99993)；最低檢測限均為0.05 mg·L-1。

1.2.4 方法驗(yàn)證：配制濃度分別為0.1、1.0和5.0 mg·L-1的MXC血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度平行5管，按文獻(xiàn)[7]考察本方法的回收率和精密度。

1.2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：日本大耳兔5只，MXC用玉米油溶解灌胃，劑量為200 mg·kg-1，分別于給藥前和給藥后 5、10、20 min，1、2、4、6、9、 12、18、24 h，取靜脈血2 mL，注入肝素化的試管，3000×g離心10 min，取血漿，-40 ℃保存?zhèn)錅y。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用中國藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)編寫的DAS藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用房室模型計(jì)算MXC的毒動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法驗(yàn)證 圖1為空白血漿、MXC純標(biāo)、MXC血標(biāo)、及含MXC的血漿樣品經(jīng)HPLC分析測定得到的色譜圖。由圖可見在本實(shí)驗(yàn)條件下，MXC與內(nèi)標(biāo)馬拉硫磷能完全分離，沒有明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾。內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為3.4 min，MXC的保留時(shí)間為7.1 min。本方法具有較高的專屬性，回收率和精密度符合生物樣品分析指導(dǎo)原則的要求[8]（見表1）。

表1 回收率和精密度

圖1 MXC血漿色譜圖

圖2 MXC濃度時(shí)間曲線

2.2 MXC在兔體內(nèi)的毒代動(dòng)力學(xué) 200 mg·kg-1MXC一次性灌胃后， 兔血漿中MXC的濃度時(shí)間曲線見圖2。結(jié)果表明，MXC在兔體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過程呈雙峰現(xiàn)象。因目前DAS軟件無法擬合雙峰現(xiàn)象，將整個(gè)體內(nèi)過程分為（0.083～4）h和（4～24）h兩個(gè)時(shí)間段處理，均符合一級動(dòng)力學(xué)二室模型。主要的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。

3 討論

MXC為重要的環(huán)境激素類農(nóng)藥，可通過多種機(jī)制而產(chǎn)生生殖毒性，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)，擬雌二醇作用，對生殖細(xì)胞及胚胎的毒性及干擾神經(jīng)、免疫系統(tǒng)的功能等[6]，已成為目前研究的熱點(diǎn)。因此有必要建立統(tǒng)一、合理、靈敏的檢測方法并開展毒代動(dòng)力學(xué)研究，以了解MXC在動(dòng)物體內(nèi)血漿濃度變化的規(guī)律及其與各系統(tǒng)毒性作用的關(guān)系。目前MXC的檢測主要采用氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法[1-2，9]，用于環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品、及生物樣品中微量農(nóng)藥殘留的檢測，鮮見毒動(dòng)學(xué)研究的報(bào)道。氣質(zhì)聯(lián)用和氣相色譜檢測法靈敏度高，峰型好，能同時(shí)分辨多種農(nóng)藥，但儀器和試劑的成本也高，樣品的前期處理復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)條件要求的較高。因MXC的毒性較低，家兔急性經(jīng)口半數(shù)致死量>2000 mg·kg-1[6]?？蛇m當(dāng)加大給藥劑量而獲得較高的血藥濃度，本實(shí)驗(yàn)中給兔灌服200 mg·kg-1的MXC，除個(gè)別動(dòng)物有輕微的中樞興奮外無其他異常中毒反應(yīng)。因此本研究嘗試用HPLC法檢測血漿樣品中的MXC濃度，并進(jìn)行整體動(dòng)物的毒代動(dòng)力學(xué)研究。

表2 MXC在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

本研究中流動(dòng)相采用乙腈和水，比例為70:30。在此條件下MXC與內(nèi)標(biāo)馬拉硫磷能完全分離，沒有明顯的內(nèi)生雜質(zhì)峰干擾。提高乙腈的比例可使MXC出峰時(shí)間提前，峰型也更好，但內(nèi)標(biāo)馬拉硫磷的出峰時(shí)間也提前，與血漿雜峰重疊；降低乙腈的比例可使MXC的出峰時(shí)間推遲，如比例為65:35時(shí)，MXC的出峰時(shí)間在10min左右，此時(shí)峰形變寬且與其后的雜峰有部分重疊。選擇內(nèi)標(biāo)時(shí)，考慮到MXC脂溶性的特點(diǎn)，嘗試了多種中樞抑制藥、有機(jī)氯及有機(jī)磷農(nóng)藥，以馬拉硫磷的出峰時(shí)間及峰型最為理想，但馬拉硫磷在血漿樣品中易被膽堿酯酶水解，因此血漿需事先用NaF處理，抑制膽堿酯酶活性。在本色譜條件下，出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形干凈利落無干擾，而且所要求的預(yù)處理方法簡便快速，適合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中大量樣本的檢測。

毒代動(dòng)力學(xué)研究表明，MXC 200 mg·kg-1灌胃后兔血漿中濃度的變化符合一級動(dòng)力學(xué)二室模型；在給藥后18 min和6 h出現(xiàn)兩次峰濃度，分別為3.66和3.59 mg·L-1，雙峰間隔時(shí)間較長，提示可能存在肝腸循環(huán)；兩個(gè)時(shí)間段消除相半衰期分別為15.12和11.01 h，說明MXC一次性染毒后可在體內(nèi)持續(xù)較長時(shí)間；MXC的血漿濃度較低，參照表2中V1、AUC及T1/2等藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析，MXC吸收完全，表觀分布容積V1偏大，半衰期較長，因此其濃度偏低的原因可能主要是在組織中有較多的蓄積。MXC為低毒類有機(jī)氯農(nóng)藥，對人畜毒性小、使用安全，臨床未見有急性中毒的報(bào)道，但其毒動(dòng)學(xué)特點(diǎn)表明MXC在體內(nèi)蓄積所致的慢性毒性仍需重視。

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