7型腺病毒溫州株基因組主要序列的克隆與分析

姜招嫦，趙娜，黃燕燕，余雪姣，彭穎

(溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

7型腺病毒溫州株基因組主要序列的克隆與分析

姜招嫦，趙娜，黃燕燕，余雪姣，彭穎

(溫州醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

目的：克隆和分析7型腺病毒溫州株（Ad7wz1）基因組主要序列ITR、E1A261R、E1B55kDa、Hexon和E3。方法：分離并提取了Ad7wz1基因組DNA，PCR擴(kuò)增得到各基因后利用PMD18 simple T載體進(jìn)行克隆，并測(cè)序分析。結(jié)果：獲得Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3和ITR-R六個(gè)基因的克隆，并測(cè)得核苷酸序列；分析表明其核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列與GenBank上已發(fā)表的Ad7全基因組序列比較同源性分別達(dá)到93.2%～100%和97.8%～100%。結(jié)論：初步確定本次分離的Ad7wz1毒株為Ad7d2型，Ad7wz1與已經(jīng)發(fā)表的Ad7病毒株序列有高度同源性，為研究Ad7的致病機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。

7型腺病毒；克隆，分子；序列分析；序列同源性

目前已知的腺病毒（adenovirus，Ad）基因序列血清型約52種，分為A～F六組，其中7型腺病毒（adenovirus type seven，Ad7）屬于B組[1]。Ad7與人類的呼吸道疾病密切相關(guān)，據(jù)WHO調(diào)查表明，全世界范圍內(nèi)Ad所導(dǎo)致的人類疾病中，約1/5由Ad7引起，尤其兒童感染Ad7會(huì)產(chǎn)生重癥呼吸道疾病甚至死亡[2]。腺病毒基因組長(zhǎng)約36 kb，其兩端各有一個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)（inverted terminal repeats，ITR），內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào)?；蚪M上含有E1（E1A、E1B）、E2（E2A、E2B）、E3、E4四個(gè)早期轉(zhuǎn)錄基因。其中E1是表達(dá)蛋白參與病毒基因和有關(guān)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，是病毒基因活動(dòng)的起始因子，E3的基因表達(dá)產(chǎn)物與病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)有關(guān)，為病毒復(fù)制的非必需區(qū)[3]。Ad7的致病性必定與其特殊的基因結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)，為此，了解Ad7基因組結(jié)構(gòu)序列，有助于研究Ad7感染致病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑：限制性核酸內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶、DNA Marker、PMD18 simple T載體均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。大腸桿菌DH5α由我室保存。

1.1.2細(xì)胞來(lái)源：A549細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，使用含10% FBS的F12培養(yǎng)基（購(gòu)自Gibco公司）在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1Ad7wz1的分離培養(yǎng)和基因組DNA提取：痰液標(biāo)本采自溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院2歲肺炎患兒，分離得到病毒株Ad7wz1并提取病毒基因組DNA。方法參照參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.2.2Ad7wz1基因組DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切及電泳：病毒基因組DNA分別用BamHI、HindIII和SmaI進(jìn)行酶切，產(chǎn)物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3引物設(shè)計(jì)并合成：參照發(fā)表的Ad7基因組全序列AY495969，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)六對(duì)PCR引物（見(jiàn)表1）并合成。

表1Ad7wz1病毒株主要基因片段的引物序列、酶切位點(diǎn)及所在基因組位置

1.2.4分子克隆及測(cè)序：PCR擴(kuò)增ITR-L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3、ITR-R六個(gè)片段。所得PCR產(chǎn)物與PMD18 simple T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在氨芐霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化菌。重組子經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定后送大連寶生物測(cè)序。

1.2.5序列分析：將測(cè)序后的各段序列與已在GenBank發(fā)表的五個(gè)Ad7基因組序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用BioEdit軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸的同源性分析。這五個(gè)基因組序列分別是：Adref1：AY495969，Adref2：AY601634[5]，Adref3：AY594256[6]，Adref4：AY594255，Adref5：BK005235。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒感染A549細(xì)胞A549細(xì)胞感染痰液腺病毒5～7d后即引起細(xì)胞腫脹、變圓、聚集成葡萄串珠狀的典型細(xì)胞病變（圖1A、圖1B）。

圖1腺病毒感染A549細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)

2.2 病毒基因組DNA的酶切圖譜病毒基因組DNA的BamHI、HindIII和SmaI酶切圖譜（見(jiàn)圖2），對(duì)照國(guó)外文獻(xiàn)，從BamHI的帶型初步確定本次分離的Ad7wz1毒株為Ad7d2型[7]。

圖2 病毒基因組DNA的酶切圖譜

2.3 Ad7wz1主要基因克隆的獲得按常規(guī)PCR法擴(kuò)增出六個(gè)片段分別為：ITR-L（500 bp）、E1A261R（780 bp）、E1B55kDa（1400 bp）、Hexon（250 bp）、E3（1200 bp）、ITR-R（514 bp）。純化后產(chǎn)物與PMD18 simple T載體克隆后用相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定，結(jié)果均與預(yù)期大小一致（見(jiàn)圖3A～F）。

2.4 序列比對(duì)及同源性分析Ad7wz1與Genbank上已發(fā)表的五個(gè)Ad7基因組相應(yīng)序列比較結(jié)果表明：核苷酸序列的同源性分別達(dá)到97.8%～99.6%、99.1%～100%、98.9%～99.9%、100%、98.8%～99.6%、93.2%～96.1%（見(jiàn)圖4A）；相應(yīng)E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3區(qū)的氨基酸序列同源性分別達(dá)到99.2%～ 100%、98.6%～99.8%、100%、97.8%～99.8%（見(jiàn)圖4B）。

圖3Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1B55 kDa、Hexon、E3、ITR-R基因PCR及酶切鑒定圖

圖4AAd7wz1主要基因與Genbank上已發(fā)表的Ad7基因組相應(yīng)序列核苷酸同源性比較

圖4BAd7wz1主要基因與Genbank上已發(fā)表的Ad7基因組相應(yīng)序列氨基酸同源性比較

2.5 基因序列突變位點(diǎn)分析Ad7wz1主要基因編碼區(qū)對(duì)應(yīng)五組參照基因組序列普遍存在的突變位點(diǎn)有：E1A261R區(qū)第613位T突變成C，造成苯丙氨酸突變成絲氨酸；E1A261R區(qū)第744位C突變成G，造成谷酰胺突變成谷氨酸；E1B55kDa區(qū)第2008位G突變成A，造成精氨酸-賴氨酸；E3區(qū)30579-30581（參照Ad7ref1）位點(diǎn)與Adref1、Adref2、Adref4、Adref5比較都發(fā)生C、T、A三個(gè)堿基連續(xù)缺失，造成移碼突變（見(jiàn)圖5）。

圖5Adwz1 E1A261R、E1B55KDa、E3編碼區(qū)基因主要突變位點(diǎn)

3 討論

Li等[8]于上世紀(jì)80年代用DNA限制性酶切分析的方法，對(duì)Ad7的分子流行病學(xué)進(jìn)行研究，建立了基因組分型方法并從基因水平上闡述了Ad7的流行特點(diǎn)。本研究分離的野生型腺病毒毒株經(jīng)酶切圖譜分析初步確定為為Ad7d2型。Ad7d2首先在以色列分離到，1995年在日本、1998年在美國(guó)也出現(xiàn)了Ad7d2的流行[7]。本研究報(bào)告Ad7d2病毒株的分離和鑒定，對(duì)Ad7d2在我國(guó)的流行趨勢(shì)分析和致病機(jī)制研究具有重要的意義。

我們利用PMD18 Simple T載體克隆了Ad7wz1基因組主要片段并測(cè)序分析，結(jié)果表明Ad7wz1與GenBank上已發(fā)表的Ad7基因組相應(yīng)核甘酸序列和氨基酸序列比較同源性分別達(dá)到93.2%～100%和97.8%～100%，由此看出Ad7wz1與這五組基因組有著高度同源性，為研究Ad7的致病機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。通過(guò)序列比對(duì)，編碼區(qū)基因共有4個(gè)位點(diǎn)的核酸突變普遍存在并導(dǎo)致了氨基酸變異。E3區(qū)在30579-30581（參照Ad7ref1）位點(diǎn)發(fā)生連續(xù)缺失并造成氨基酸變異的情況比較普遍，E3區(qū)的序列分析是我們研究Ad7基因組結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致免疫原性變異的基礎(chǔ)，這有助于我們深入分析E3區(qū)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的變異對(duì)細(xì)胞免疫分子表達(dá)的影響。

[1]Zhang QW, Su XB, Seto D, et al . Construction and characterization of a replication competent human adenovirus type 3-based vector as a live-vaccine candidate and a viral delivery vector [J]. Vaccine,2009,27(1):1145-1153.

[2]Purkayastha A, Su J, Carlisle S,et al. Genomic and bioinformatics analysis of HAdV-7, a human adenovirus of species B1 that causes acute respiratory disease: implications for vector develop-pment in human gene therapy [J]. Virology,2005,32(12):114-129.

[3]Luo JY, Deng ZL, Luo XJ, et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system [J]. Nature Protocols,2007,2(5):1236-1247.

[4]沈鑫烽,申寶玲,黃燕燕,等.7 型腺病毒E1A 基因克隆及真核表達(dá)[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志,2008, 30(2):196-200.

[5]Malanoski AP, Lin BC, Stenger DA, et al. A model of basecall resolution on broad-spectrum pathogen detection resequencing DNA microarrays[J]. Nucleic Acids Res,2008, 36(6):3194-3201.

[6]Purkayastha A, Ditty S E,Su J, et al. Genomic and bioinformatics analyses of HAdV-4vac and HAdV-7vac, two human adenovirus (HAdV) strains that constituted original prophylaxis against HAdV-related acute respiratory disease, a reemerging epidemic disease[J]. J Clin Microbiol,2005,43(7): 3083-3094.

[7]Cook JL, Miura TA, Ikle DN, et al. E1A oncogene-induced sensitization of human tumor cells to innate immune defenses and chemotherapy-induced apoptosis in vitro and in vivo[J]. Cancer Res,2003,63(12):3435-3443.

[8]Li QG, Henningsson A, Juto P,et al. Use of restriction fragment analysis and sequencing of a serotype-specific region to type adenovirus isolates[J]. J Clin Microbiol,1999,37(3): 844-847.

（本文編輯：吳健敏）

Cloning and analysis of main sequences of adenovirus type 7 Wenzhou strain genome

Jiang Zhaochang，Zhao Na，Huang Yanyan，Yu Xuejiao，Peng Ying.School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective: To clone and analyze of main sequences of adenovirus type 7 Wenzhou strain genome(Ad7wz1)，including ITR，E1A261R，E1B55kDa，Hexon，and E3. Methods:Ad7wz1 genome was isolated and purified， each gene putting into PMD18 simple T vector after amplified by PCR was cloned，then sequenced. Results:Six genes of Ad7wz1，including ITR-L，E1A261R， E1B55kDa，Hexon，E3 and ITR-R were cloned. The result of sequencing showed that the homology of the nucleotide sequence was 93.2%～100% and the homology of the commensurate amino acid sequence was 97.8%～100% after comparied with genomewide sequence of the Ad7 strain reported in GenBank. Conclusion:Ad7wz1 is ascertained as type Ad7d2 initialy，which shows a high homology with corresponding region of Ad7 strain reported，it affords the important theoretical basis for research on Ad7 pathogenesis.

adenovirus type 7；cloning molecular；sequence analysis；sequence homology

book=7,ebook=10

R373.1；Q78

A

1000-2138 (2010)04-0339-04

2009-09-22

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y205188)。

姜招嫦（1986-），女，浙江溫州人，碩士生。