HPLC 法測(cè)定夏天無(wú)薄膜衣片中原阿片堿的含量

蘇玉嚴(yán)，周海妹，展學(xué)孔，陳文平（.海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院藥劑科，海口市5703；.海南全星醫(yī)藥研究院，?？谑?5706）

夏天無(wú)薄膜衣片為夏天無(wú)經(jīng)加工制成的片劑，其功效為活血通絡(luò)、行氣止痛。臨床上用于瘀血阻絡(luò)、氣行不暢所致的中風(fēng)，癥見(jiàn)半身不遂、偏身麻木，或跌撲損傷、氣血瘀阻所致的肢體疼痛、腫脹麻木；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛見(jiàn)上述證候者[1]。由于夏天無(wú)片在1994～2008年處于中藥保護(hù)品種保護(hù)范圍之內(nèi)，所以到目前為止，尚無(wú)采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)夏天無(wú)薄膜衣片含量進(jìn)行測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)通過(guò)建立HPLC法對(duì)該藥的指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，從而為夏天無(wú)薄膜衣片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HPLC色譜儀，配備SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、LC-10Atvp泵（日本島津公司）；色譜柱（天津天和公司）；2010色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司，型號(hào)：UV-2450）；BS 124S萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯北京有限公司）；超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，型號(hào)：SK-2500，功率：53 kHz）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司，型號(hào)：HH-4）等。

1.2 試藥

原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110853-200402）；夏天無(wú)薄膜衣片供試品（海南全星藥物研究院制劑室，批號(hào)：20090301、20090302、20090303，規(guī)格：每片重0.3 g）。乙腈、三乙胺、甲醇均為色譜純，水為注射用水，鹽酸、冰醋酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×460 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；流動(dòng)相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（取三乙胺8 mL，冰醋酸30 mL，加水稀釋至1 000 mL，18∶82）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：289 nm。理論塔板數(shù)按原阿片堿計(jì)算≥3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精密稱(chēng)取原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置于50 mL容量瓶中，用1%鹽酸5 mL溶解，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為40μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備：取本品10片，除去薄膜包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，稱(chēng)取樣品0.6 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%的甲醇50 mL，稱(chēng)重，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)重，用50%的甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取50%甲醇溶液（溶劑空白）、標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入HPLC儀。結(jié)果，原阿片堿的色譜峰保留時(shí)間適宜，且供試品溶液中主峰與其余各峰分離效果較好。色譜見(jiàn)圖1。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

圖1 高效液相色譜圖A.溶劑空白；B.標(biāo)準(zhǔn)品；C.供試品Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solvent；B.reference substance；C.test sample

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1、3、5、7、9 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為8.48、25.44、42.40、59.36、76.32 μg·mL－1的系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為Y＝7 505 4X－2 052 0（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，夏天無(wú)薄膜衣片中原阿片堿的質(zhì)量濃度在8.48～76.32μg·mL－1的范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

圖2 夏天無(wú)薄膜衣片中原阿片堿的含量測(cè)定線(xiàn)性回歸圖Fig 2 Linear regression of content determination of protopine in C.decumbens film-coated tablets

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)量6次。結(jié)果，RSD＝0.63%（n＝6），表明儀器精密度良好，詳見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of precision test（n＝6）

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液1份適量，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)量。結(jié)果RSD＝0.73%，表明供試品溶液在1個(gè)工作日內(nèi)穩(wěn)定，詳見(jiàn)表2。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20090301）6份，精密稱(chēng)定，分別為0.601 2 g、0.601 8 g、0.601 3 g、0.600 9 g、0.602 1 g、0.601 0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取20μL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果RSD＝1.25%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好，詳見(jiàn)表3。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of stability test（n＝5）

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of repeatable test（n＝6）

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品13.3 mg，置于25 mL容量瓶中，制備濃度為0.532 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。采用加樣回收法，精密稱(chēng)取已測(cè)定含量（3.504 mg·g－1）的同一批號(hào)樣品6份，每份0.3 g（0.302 5 g、0.298 8 g、0.300 4 g、0.302 6 g、0.299 6 g、0.301 2 g），分別加入濃度為0.532 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液2 mL和50%的甲醇50 mL，依“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行溶液制備，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各20μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，原阿片堿的平均回收率為99.39%，RSD＝0.92%（n＝6），詳見(jiàn)表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取本品3個(gè)批號(hào)（20090301、20090302、20090303；規(guī)格：每片0.3 g），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取20μL進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 5 Results of content determination（n＝3）

3 討論

3.1 含量測(cè)定方法的選擇

由于夏天無(wú)薄膜衣片的樣品處理方法比較簡(jiǎn)單，僅是采用加熱回流的方法進(jìn)行提取，所以本文在選擇該樣品內(nèi)原阿片堿含量測(cè)定方法時(shí)，優(yōu)先考慮采用簡(jiǎn)單易行的外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，并對(duì)該方法進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及含量測(cè)定方法學(xué)考察。結(jié)果，采用本法測(cè)定夏天無(wú)薄膜衣片中原阿片堿含量時(shí)，其它成分干擾較少、分離度佳、回收率高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，符合國(guó)家對(duì)藥品含量測(cè)定的要求。此外，在含量測(cè)定過(guò)程中，筆者采用定量環(huán)進(jìn)樣，這樣不僅克服了外標(biāo)法對(duì)進(jìn)樣量要求精確之難題，同時(shí)也避免了使用內(nèi)標(biāo)法尋找內(nèi)標(biāo)物的困難和操作步驟煩瑣所帶來(lái)的誤差。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于不同的文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)原阿片堿測(cè)定所采用的波長(zhǎng)不一樣，為確定試驗(yàn)中最終的檢測(cè)波長(zhǎng)，本文通過(guò)利用原阿片堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用紫外分光光度法（《中國(guó)藥典》（2005年版）附錄ⅤA）測(cè)定，在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)掃描，掃描圖譜顯示，原阿片堿在240、289 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收。故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道，最終選擇289 nm為本品的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 樣品處理時(shí)間的選擇

在供試品的處理當(dāng)中，本文采用水浴回流的提取方法，并對(duì)回流提取的時(shí)間進(jìn)行了考察。取同批等量樣品3份，分別加熱回流法提取45、60、75 min，得樣品溶液。各取樣品溶液20μL注入HPLC儀進(jìn)行測(cè)定。含量測(cè)定結(jié)果表明，除了回流法提取45 min的樣品含量較低之外，60 min與75 min時(shí)樣品的含量無(wú)明顯差異。綜合考慮，最終選擇樣品的回流法提取時(shí)間為60 min。

綜上所述，本研究建立了HPLC法測(cè)定夏天無(wú)薄膜衣片中原阿片堿含量的方法，該法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于夏天無(wú)薄膜衣片的質(zhì)量控制。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：196.

[2]潘成學(xué)，劉 偉，申小靜.HPLC測(cè)定夏天無(wú)膠囊中原阿片堿的含量[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，40（4）：722.

[3]李向陽(yáng)，屠萬(wàn)倩.HPLC測(cè)定夏天無(wú)膠囊中原阿片堿的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2005，16（4）：272.