替考拉寧手性固定相分離克倫特羅對映體

隨著醫(yī)藥學和生命科學的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)藥物對映異構(gòu)體在藥理、毒理和臨床療效等方面存在著較大的差異，因此藥物對映體的拆分工作具有重要意義。克倫特羅(Clenbuterol)是β2腎上腺受體激動劑，主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣[1]，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 克倫特羅的結(jié)構(gòu)式

克倫特羅分子中含有一個手性中心，目前臨床上應用的克倫特羅均為外消旋體，但研究表明臨床上有效的一般為其(-)-異構(gòu)體，而(+)-異構(gòu)體則對療效沒有貢獻[2]。目前，關(guān)于克倫特羅單一對映體的藥理活性、藥代動力學研究罕見文獻報道，建立克倫特羅手性分離方法對深入研究其對映體的藥效、藥理作用具有重要意義。因此，有必要對克倫特羅對映體進行拆分研究，建立快速、靈敏、分離性能好的測定方法。

目前，藥物的拆分方法主要有高效液相色譜法和毛細管電泳法。宋雅茹等[3]將酰胺型手性固定相用于高效液相色譜拆分克倫特羅對映體；唐琴等[4]用Whelk-O1手性固定相成功拆分了克倫特羅對映體；黃可龍等[5]用毛細管電泳法以羥丙基-β-環(huán)糊精為手性添加劑拆分了克倫特羅。但至今還沒有關(guān)于利用替考拉寧手性固定相對克倫特羅進行手性拆分的報道。替考拉寧手性固定相的結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖2 替考拉寧手性固定相結(jié)構(gòu)式

作者首次采用替考拉寧手性固定相對克倫特羅對映體進行了分離，并從結(jié)構(gòu)上探討了手性分離的機制。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

鹽酸克倫特羅，青島雙鯨藥業(yè)；甲醇(MeOH)、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃，色譜純，天津市康科德科技有限公司；冰醋酸(HAc)、三乙胺(TEA)、硝酸銨，特級純，天津市博迪化工有限公司。

Jasco UV-980型高壓輸液泵、Jasco UV-975型檢測器，Jasco 日本分光公司；IC 2001 plus 型柱溫箱；Anastar 色譜工作站，U6K型進樣閥(20 L定量環(huán))；DT-100A型分析天平；PHS-25型pH計；DL-180型超聲波清洗機。

1.2 色譜條件及分離影響

藥物對照品用甲醇溶解，配制成濃度為1.0 mg·mL-1的供試液。

色譜柱:Chirobiotic T (150 mm×4.6 mm ,5 μm) (Advanced Separation Technologies Inc．，美國);流速:1.0 mL·min-1；紫外檢測波長:254 nm；進樣量:2 μL。

考察分離模式、流動相組成、柱溫等因素對克倫特羅對映體分離的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離模式的選擇

替考拉寧手性固定相有正相、反相和新極性有機相三種分離模式。

在正相模式下，考察了兩種流動相系統(tǒng):正己烷/乙醇和正己烷/異丙醇，并通過改變流動相組成以實現(xiàn)手性分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此模式下，克倫特羅對映體在替考拉寧手性固定相上不能實現(xiàn)分離。

在反相模式下，首先采用廠家建議的0.1%TEA(pH值4.1)-20%甲醇為流動相，考察了克倫特羅保留行為和選擇性受有機改性劑的性質(zhì)和濃度、緩沖溶液的性質(zhì)、濃度和pH值的影響，但通過優(yōu)化這些分離條件，克倫特羅對映體在替考拉寧手性固定相上均不能實現(xiàn)分離。

在新極性有機相模式下，克倫特羅對映體可獲得分離，因此，選擇分離模式為新極性有機相。

2.2 緩沖溶液的選擇

在新極性有機相模式下，考察了醋酸銨、硝酸銨和1%醋酸-三乙胺緩沖系統(tǒng)對分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克倫特羅在1%醋酸-三乙胺緩沖系統(tǒng)中可以實現(xiàn)手性分離。

2.3 流動相組成的確定

以1%醋酸-三乙胺為緩沖系統(tǒng)，以甲醇-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng)作為流動相，考察了冰醋酸和三乙胺的濃度和比例對分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在替考拉寧手性固定相上，當流動相只含冰醋酸時，克倫特羅只能檢測到一個變形的色譜峰，不能實現(xiàn)手性分離；在只含三乙胺的流動相中，克倫特羅對映體可實現(xiàn)一定的分離，但峰形不佳；在三乙胺存在的前提下，冰醋酸的加入可以改善色譜峰的峰形和對稱性，兩者比例為1∶1時克倫特羅對映體的分離效果最佳。因此，本實驗采用甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.1∶0.1,體積比)為起始流動相，考察了緩沖溶液成分(冰醋酸/三乙胺)的濃度對克倫特羅在替考拉寧手性固定相上保留行為和對映體選擇性的影響，結(jié)果見表1。

表1 新極性有機相模式下流動相組成對克倫特羅對映體在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響

注：流速為 1.0 mL·min-1， 柱溫為20℃

由表1可知，隨著冰醋酸/三乙胺的濃度從0.1%降低至0.02%或0.01%，克倫特羅的保留時間明顯延長，分離效果顯著提高；但當冰醋酸/三乙胺的濃度繼續(xù)降低至0.005%時，克倫特羅的保留時間過長，色譜峰展寬，分離效果下降。當甲醇-冰醋酸-三乙胺的體積比為100∶0.01∶0.01時，克倫特羅對映體可實現(xiàn)基線分離，最大分離度達3.75，分離色譜圖見圖3。因此，確定最佳流動相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01，體積比)。

注：流動相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,體積比)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為20℃

2.4 柱溫的選擇

柱溫對分離度和保留時間有著重要的影響。以甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,體積比)為流動相，考察了克倫特羅對映體在10℃、20℃、30℃和40℃下的分離情況，結(jié)果見表2。

表2 溫度對克倫特羅在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響

由表2可知，隨著溫度的升高，克倫特羅的保留時間和對映體選擇性均相應降低，權(quán)衡分離度、保留時間及實際操作性，選取最佳分離溫度為20℃。

2.5 分離機制的探討

替考拉寧分子中含有多種官能團和不對稱中心，可與被分析物質(zhì)產(chǎn)生多種作用，如疏水作用、包合作用、偶極-偶極作用、π-π誘導作用、氫鍵作用、空間位阻作用及范德華相互作用?？藗愄亓_的結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)、羥基、鹵素和氨基基團，可以與手性選擇劑上相應的官能團發(fā)生相互作用從而實現(xiàn)手性分離。新極性有機相模式可以提升這些相互作用，因此在此模式下，克倫特羅對映體達到了在正相和反相模式下不能實現(xiàn)的分離效果。而在新極性有機相模式下，必須有三乙胺存在于流動相中才可實現(xiàn)克倫特羅對映體的分離，當流動相中同時含有三乙胺和冰醋酸時，分離效果最佳，這說明離子作用是此模式下對映體分離的最主要作用機制，而克倫特羅的手性分離是上述提到的各種相互作用的共同結(jié)果。

3 結(jié)論

采用替考拉寧手性固定相成功實現(xiàn)了克倫特羅對映體的直接分離，確定最佳色譜條件為：流動相為甲醇-冰醋酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01，體積比)，流速1.0 mL·min-1，柱溫20℃。在此條件下，克倫特羅對映體可實現(xiàn)基線分離，最大分離度達3.75。該方法簡單，操作方便，可以用于克倫特羅對映體的質(zhì)量控制及立體選擇性藥代動力學的研究。

參考文獻：

[1] 孫定人,張石革,梁之江.國家臨床新藥集[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2001:358-359.

[2] Gausepohl C,Blaschke G.Stereoselective determination of clenbuterol in human urine by capillary electrophoresis[J].Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications,1998,713(2):443-446.

[3] 宋雅茹,王德發(fā),楊亦平,等.酰胺型手性固定相直接拆分克倫特羅對映體[J].色譜，2002,20(2)：118-120.

[4] 唐琴,宋航,付超,等.高效液相色譜手性固定相法拆分克倫特羅對映體[J].分析化學,2004,32(6):755-758.

[5] 黃可龍,胡衛(wèi)國,王蔚玲,等.高效毛細管電泳對克倫特羅對映體的分離及定量檢測[J].分析科學學報，2007,23(1)：9-12.